项目概述

项目编号GDDxxxx
项目名称4 samples MetaGenome
样品名称G1¦G2¦G3¦BL
分组方案G :G1&G2&G3¦BL :BL

技术简介

实验简介

实验流程图
信息分析简介

信息分析流程图

测序评估

测序质量评估
  • G1
  • G2
  • G3
  • BL
碱基组成与质量分析
  • G1
  • G2
  • G3
  • BL

样品 G1 过滤前 碱基组成分布图

样品 G1 过滤后 碱基组成分布图

样品 G2 过滤前 碱基组成分布图

样品 G2 过滤后 碱基组成分布图

样品 G3 过滤前 碱基组成分布图

样品 G3 过滤后 碱基组成分布图

样品 BL 过滤前 碱基组成分布图

样品 BL 过滤后 碱基组成分布图

过滤信息统计
过滤前后碱基信息统计表
SampleBefore FilterAfter Filter
Clean Data(bp)Q20(%)Q30(%)N(%)GC(%)HQ Clean Data(bp)Q20(%)Q30(%)N(%)GC(%)
G1 12071258500 (100.00%) 11459771973 (94.93%) 10849816737 (89.88%) 80354 (0.00%) 7453482626 (61.75%) 12069329500 (99.98%) 11457947115 (94.93%) 10848091736 (89.88%) 80334 (0.00%) 7452319979 (61.75%)
G2 12499735750 (100.00%) 11858673863 (94.87%) 11215251295 (89.72%) 78068 (0.00%) 7722599256 (61.78%) 12497731000 (99.98%) 11856784199 (94.87%) 11213469469 (89.72%) 78052 (0.00%) 7721392526 (61.78%)
G3 15298408000 (100.00%) 14615017561 (95.53%) 13896773535 (90.84%) 101180 (0.00%) 9569971459 (62.56%) 15296055500 (99.98%) 14612781330 (95.53%) 13894652920 (90.84%) 101169 (0.00%) 9568536267 (62.56%)
BL 11667635000 (100.00%) 11100278599 (95.14%) 10526263408 (90.22%) 79144 (0.00%) 7248747072 (62.13%) 11665814750 (99.98%) 11098553545 (95.14%) 10524630121 (90.22%) 79136 (0.00%) 7247643265 (62.13%)


Reads 过滤信息统计表
SampleClean Reads NumHQ Clean Reads Num(%)Read LengthAdapter(%)Low Quality(%)Poly A(%)N(%)
G1 96570068 96554636 (99.98%) 125+125 7709 (0.02%) 0 (0%) 7 (0%) 0 (0%)
G2 99997886 99981848 (99.98%) 125+125 8009 (0.02%) 0 (0%) 10 (0%) 0 (0%)
G3 122387264 122368444 (99.98%) 125+125 9404 (0.02%) 0 (0%) 6 (0%) 0 (0%)
BL 93341080 93326518 (99.98%) 125+125 7279 (0.02%) 0 (0%) 2 (0%) 0 (0%)

宏基因组组装

宏基因组组装主要分为3步:单样本组装,多样本组装结果合并和丰度过滤。

宏基因组组装流程
单样本组装

经过数据质控后的得到的HQ Clean Data,使用SOAP denovo(版本: 2-src-r240,参数:-d 1 -M 3 -D 1 -F)组装软件进行组装。 对于单个样品,首先选取不同的Kmer(选取55 59 63)进行组装,再从中选取N50的最大的scaffolds组装结果作为该样品的最终组装结果。 将组装得到的scaffolds从N连接处打断,得到不含N的序列片段,成为scaftig。

结果文件在文件夹:upload/02.assembly下。

多样本组装结果合并

为了便于对多个样品之间进行比较,需要将多个样品的组装结果合并在一起,去冗余,然后再进行下面的分析。 采用Uclust(版本:1.2.22,参数:-id 0.90)软件对各个样品组装得到的所有Scaftigs进行去冗。

结果文件在文件夹:upload/03.cluster下。

备注:在丰度分析中,会根据丰度的结果对上述的Scaftigs结果进行进一步过滤(过滤掉在各个样本中丰度之和为0的Scaftigs),详见丰度分析

组装结果统计

All of Uclust filter 表示经过Uclust去冗余后得到的Scaftigs。
All of Abundance filter 表示经过丰度过滤后得到的Scaftigs,在丰度分析中会说明具体的方法。

说明:SampleID表示样本名称,Flag表示Scaftigs的类型;Number表示Scaftigs的数量;Total len.(bp)表示Scaftigs的总长;Average Len.(bp) 表示 Scaftigs 的平均长度; N50,N90 表示将 Scaftigs 按照长度进行排序,然后由长到短加和,当加和值达到 scaftigs 总长的 50%,90%时的 Scaftigs 的长度值;Max Len.表示得到的最长Scaftigs长度; Min Len.表示得到的最短Scaftigs长度;GC(%)表示Scaftigs的GC含量。

各样品组装结果Scaftigs统计表
SampleID or FlagNumberTotal len.(bp)Average Len.(bp)N50 Len.(bp)N90 Len.(bp)Max Len.(bp)Min Len.(bp)GC(%)
G128385891396967321.98329193293066460.96%
G231514098947007313.98307192142693660.60%
G3462123146289098316.56317195109076461.71%
BL14133846380007328.1534219647566560.97%
All of Uclust filter859743296987379345.44357199293066661.07%
All of Abundance filter857838296699193345.87357199293066661.07%
组装结果scaftigs长度分布

说明:X轴表示Scaftigs的长度值,大于3000统一看做3000;左侧的Y轴(Frequence#)表示Scaftigs的数目(频数), 右侧的Y轴(Percentage%)表示Scaftigs数目占Scaftigs总数的百分比。

  • G1
  • G2
  • G3
  • BL
  • All of Uclust Filter
  • All of Abundance filter

物种注释及丰度分析

丰度分析

为了进一步分析样本中各个Scaftigs的相对丰度,将经过质控后、过滤掉宿主(如果存在)后的HQ Clean Reads, 用BWA(版本:0.7.5a-r405,参数:默认)软件与非冗余的参考Scaftigs集进行比对,然后统计各个Scaftigs在各个样品中的深度情况, 过滤掉在各个样品中深度之和为0的Scaftigs,得到最终的参考Scaftigs集合及其中各个Scaftig在各个样品中的深度表,即丰度表。

结果文件在文件夹:upload/04.abundance下。

Scaftigs丰度表(部分展示)
scaftigs_idlengthG1G2G3BL
G1_00000129306103.671.382.161.2
G1_0000021680194.350.30.640.37
G2_0000011426911.414.537.616.18
G2_0000021414111.1613.837.495.83
G1_0000031319941.710.20.740.2
G1_0000041304930.210.30.990.19
G2_0000031292011.9413.976.98.13
G2_0000041276713.914.829.868.69
G1_0000051176524.940.060.110.04
G2_000005114708.8712.195.24.69

说明:第一列为Scaftigs ID;第二列为Scaftigs的长度;其余列为各样品中对应Scaftigs的平均深度(绝对丰度)。


说明:图中三个圈分别代表3种Scaftigs的数量,蓝色为未过滤前由全部样本组装结果合并而成的Scaftigs(Raw Scaftigs);绿色部分为Raw Scaftigs经过Uclust聚类去冗余后的Scaftigs(Uclust Scaftigs);红色部分为Uclust Scaftigs过滤掉所有样本深度之和为0的Scaftigs后剩下的Scaftigs(Ref Scaftigs/Last Scaftigs)。

全部样品Scaftigs数量变化靶心图
物种注释

将经过丰度过滤后得到的参考Scaftigs集合与微生物NT库,使用BLAST+(版本:2.2.29,参数:-evalue 1e-5)进行比对。 由于每条序列可能对应多个比对结果,会得到多个不同的分类级别,所以采用LCA算法(使用BioPerl实现), 将出现第一个分支前的分类级别,作为该序列的最终物种注释结果。

结果文件在文件夹:upload/05.taxonomy下。

备注:微生物NT库是从NCBI的NT(版本:20151021)数据库中抽提出来的,抽提的物种包括细菌,真菌,古菌和病毒。

Scaftigs丰度和物种注释总表(部分展示)
Scaftig_idG1_avgDepthG2_avgDepthG3_avgDepthBL_avgDepthG1_relativeAbundanceG2_relativeAbundanceG3_relativeAbundanceBL_relativeAbundanceKingdomPhylumClassOrderFamilyGenusSpecies
G1_000001103.671.382.161.20.0000150.0000000.0000000.000000
G1_00000294.350.30.640.370.0000130.0000000.0000000.000000
G2_00000111.414.537.616.180.0000020.0000020.0000010.000001BacteriaNitrospiraeNitrospiraNitrospiralesNitrospiraceaeNitrospiraNitrospira moscoviensis
G2_00000211.1613.837.495.830.0000020.0000020.0000010.000001
G1_00000341.710.20.740.20.0000060.0000000.0000000.000000
G1_00000430.210.30.990.190.0000040.0000000.0000000.000000
G2_00000311.9413.976.98.130.0000020.0000020.0000010.000002Bacteria
G2_00000413.914.829.868.690.0000020.0000020.0000010.000002Bacteria
G1_00000524.940.060.110.040.0000040.0000000.0000000.000000
G2_0000058.8712.195.24.690.0000010.0000020.0000010.000001

说明:第一列为Scaftigs ID;列名*_avgDepth表示Scaftigs的平均深度;*_relativeAbundance表示Scaftigs在该样品中的相对丰度; Kingdom,Phylum,Class,Order,Family,Genus,Species分别对应界门纲目科属种的物种注释(空白的表示在该水平没有物种注释结果)。


说明:图中x轴为物种分类水平(界门纲目科属种),Y轴为Scaftigs的数量,图中红色部分为有对应物种分类的Scaftigs数量,青色部分为没有对应物种分类的Scaftigs数量。

Scaftigs在各个物种分类水平上的注释率
物种丰度统计

根据Scaftigs物种注释的结果,结合其丰度信息,可以获取各个分类层级(界门纲目科属种)上的相对丰度表。 然后从门水平的相对丰度表出发,选取出在各个样品中的最大相对丰度排名前10的门分类,将其余的物种设置为Others, 其中还有一些Scaftigs没有NT库注释,统一设置为Unassigned,然后绘制出各个样品对应的物种注释结果在门水平上的统计柱状图。

结果文件在文件夹:upload/05.taxonomy/profiling下。

门水平上的物种分类丰度表(部分展示)
LevelPhylumG1G2G3BL
2Acetothermia0.0000140.0000140.0000150.000013
2Acidobacteria0.0073350.0067130.0063090.007260
2Actinobacteria0.0075990.0080510.0101810.008749
2Aquificae0.0000030.0000040.0000020.000003
2Armatimonadetes0.0000600.0000640.0000640.000062
2Ascomycota0.0002780.0002750.0002550.000279
2Bacteroidetes0.0003820.0003840.0003310.000383
2Basidiomycota0.0000850.0000810.0000820.000093
2Bathyarchaeota0.0000020.0000000.0000000.000001
2Candidatus Saccharibacteria0.0000010.0000010.0000000.000000

说明:第一列Level为分类水平次序(门的次序为2);第二列为对应水平(门)的分类;其余列为各样品中在该分类水平的丰度信息。


说明:X轴为各个样品的名称,Y轴为注释到某类物种的序列占全部序列的相对丰度百分比,不同的颜色块表示不同的物种,详见右侧的图例说明。

物种注释结果在门水平上的堆叠图
物种丰度聚类

根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息,选取丰度排名前 35 的属及它们在每个样品中的丰度信息绘制热图,并从分类信息和样品间差异两个层面进行聚类。

结果文件在文件夹:upload/05.taxonomy/profiling下。


说明:横向(X轴)为各个样品的名称,纵向(Y轴)为物种的注释信息。图中左侧的聚类树为物种聚类树;上方的聚类树为样品聚类树;中间的热图对应的值为每一行物种相对丰度经过标准化后得到的Z值。

属水平上的物种丰度聚类及热图

基因预测及丰度分析

基因预测

选取长度不小于(>=)300bp的Scaftigs数据,使用MetaGeneMark(版本:3.26,参数:默认参数)软件进行基因预测。 MetaGeneMark采用启发式算法,并且拥有宏基因组数据预测训练模型,因此更加适用于 宏基因组 和未知原核生物的基因预测。

结果文件在文件夹:upload/06.genes下。

基因去冗余

采用CD-HIT(版本:version 4.6,默认选择参数:-c 0.90)软件对MetaGeneMark预测得到的基因的蛋白序列进行聚类, 选取最长的序列为每类的代表性序列,然后最为最终的去冗余基因集(非冗余基因集)。

结果文件在文件夹:upload/06.genes下。

基因基本信息统计表
CD-HIT去冗余前基因集CD-HIT去冗余后基因集
ORF number (#) 321514 223045
Total Length (bp) 141527763 101902503
Average Length (bp)440.19456.87
GC content (%) 61.53% 61.54%

基因长度分布图

说明: 图中X轴为基因长度,大于1600的算做1600;左侧Y轴(Frequence #)为基因的数量(频数),右侧Y轴(Percentage%)为该长度范围基因所占基因总数的百分比。

  • CD-HIT去冗余前基因集
  • CD-HIT去冗余后基因集
基因丰度分析

为了进一步分析各个样品中基因的丰度信息,根据基因来源的Scaftigs在各个样本中的单碱基位点深度及基因的位置信息, 可以得到各个非冗余基因在各个样品中所对应的深度表,即丰度表。

其中Depth为基因所在Scaftigs单个位点的深度,start和end分别为基因的起始和终止位置。

基因丰度计算公式

结果文件在文件夹:upload/06.genes下。

基因丰度表(部分展示)
GENEIDG1G2G3BL
gene_174.439700.09930.234
gene_2106.17160.92961.80090.6931
gene_3108.58720.12540.30280.2691
gene_4111.34991.79941.4081.0277
gene_5104.6971.82031.61470.6061
gene_698.22490.8790.96380.3282
gene_788.46730.34270.06230.1184
gene_894.65490.48120.08920
gene_982.54840.02150.16130.172
gene_1096.74473.02432.75282.4113

功能注释及其丰度分析

功能注释主要是基于功能同源的序列往往具有序列相似性的原理,将去冗余后的基因蛋白序列,与不同的蛋白功能数据库进行序列比对, 然后用比对到的序列的功能作为目标序列的功能。 在比对的过程中,由于每一条序列比对结果可能有很多个,为了保证后续分析的生物学意义,使用阈值evalue<=1e-5进行过滤, 然后再从每条序列的比对结果中筛选出 score值最高的20条作为该序列的比对结果。然后根据各个数据库的特点进行统计汇总, 并结合去冗余基因的丰度表,进行功能丰度分析。

目前注释的数据库主要有:

KEGG

KEGG,全称Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,是一个关于基因功能注释方面的综合性数据库,包括基因的功能,分类,代谢通路(KEGG Pathway数据库, 是KEGG最核心的数据库)等诸多方面的信息。

KEGG Pathway数据库将生物代谢通路划分为6大类(A级分类),分别为:新陈代谢(Metabolism)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、 环境信息处理(Environmental Information Processing)、细胞过程(Cellular Processes)、生物体系统(Organismal Systems)、 人类疾病(Human Diseases),其中每大类又被系统分类为B、C、D3个级别。 其中B级分类目前包括有 43 种子功能;C级分类即为代谢通路图;D级分类为每个代谢通路图的具体注释信息。

目前注释所用的KEGG数据库版本为:Release 76.0, October 1, 2015,比对软件使用BLAST+(版本:2.2.29,参数: -evalue 1e-5)。

结果文件在文件夹:upload/07.function/01.KEGG下。

blast 比对 KEGG 结果表
Query_idSubject_idIdentityAlign_lengthMiss_matchGapQuery_startQuery_endSubject_startSubject_endE_valueScoreSubject_annotation
gene_25cck:Ccar_1616023.8755331922129674585152e-1794.4terminase
gene_25ctet:BN906_0240225.8942123616129548584033e-1586.7bacteriophage terminase
gene_25clj:CLJU_c1683021.7655633619129677585214e-1483.6bacteriophage terminase
gene_25ppo:PPM_329225.953432021081408323374e-1483.6gp17a; DNA packaging protein Gp17 Terminase
gene_25blr:BRLA_c03117023.084422271582502323812e-1381.6large terminase protein
gene_25ppo:PPM_264926.443482081174408253372e-1381.6gp17; DNA packaging protein Gp17
gene_25pih:UB51_1288027.083361931181401323305e-1277.0DNA packaging protein
gene_25dai:Desaci_202424.6528417510129403543077e-1276.6Terminase-like family
gene_25clb:Clo1100_371927.363181871591403263044e-1173.9Terminase-like family
gene_25btm:MC28_080528.3728216811129404563096e-1173.6DNA packaging protein Gp17


基因的 Pathway 列表(部分展示)
KEGG_A_classKEGG_B_classPathwayCount (47535)Pathway IDGenesKOs
MetabolismGlobal and OverviewCarbon 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K00830+K01966+K00282+K00600+K01847+K05606+K14448+K01638+K01915+K01849+K00123+K01625+K07246+K18123+K00281+K02437+K00605+K01637+K00382+K01681+K00015+K00042+K01625+K00626+K00382+K14447+K00042+K00382+K01647+K00127+K01915+K00626+K01816+K14447+K00283+K01966+K01847+K01569+K01915+K00104+K11472+K00104+K00284+K00865+K01647+K00282+K00123+K00123+K01091+K01647+K00123+K11472+K00104+K02437+K00626+K01601+K11472+K14448+K01432+K11472+K01091+K01647+K00123+K00124+K00605+K00605+K00600+K00123+K14449+K03781+K00284+K03780+K11473+K11472+K00042+K14447+K00626+K00126+K00626+K05606+K00626+K00605+K02437+K01681+K00283+K01432+K11517+K01965+K00605+K00122+K00626+K01681+K01915+K01647+K01915+K01848+K01091+K01637+K03781+K00282+K01625+K00626+K00600+K01647+K03781+K00104+K01915+K00123+K01458+K01915+K00123+K01847+K03781+K00122+K00123+K01681+K00605+K01091+K00281+K08691+K11473+K03418+K07130+K00015+K01569+K05606+K00124+K00123+K00127+K01681+K01965+K01915+K01091+K05606+K00018+K11473+K14448+K00127+K01847+K01458+K00626+K01847+K00024+K01681+K00830+K01915+K00382+K14446+K03781+K00023+K01458+K01638+K00281+K00122+K03781+K01637+K00123+K01848+K01681+K01915+K00626+K00123+K01847+K11473+K07246+K00382+K00830+K00830+K00104+K01647+K03781+K14446+K00600+K01965+K00050+K00024+K00284+K01848+K01847+K01847+K01816+K08691+K00050+K14449+K01601+K11473+K11472+K01638+K07246+K00281+K00283+K18121+K00050+K01638+K00023+K00382+K00382+K00830+K00104+K00605+K00023+K01647+K11473+K01915+K14447+K01647+K11472+K00600+K01915+K08691+K00122+K11473+K00023+K11473+K00123+K00124+K00282+K00123+K00123+K01433+K00605+K00626+K01432+K00122+K03781+K01432+K01966+K00050+K01577+K00626+K01681+K00626+K00023+K00123+K07246+K00123+K00123+K00626+K00282+K00284+K00123+K01681+K00283+K00605+K14446+K01637+K01569+K01915+K00123+K01569+K01681+K00024+K14447+K00382+K01432+K00123+K00104+K03781+K00283+K00282+K02437+K00605+K00283+K00015+K01637+K01577+K00382+K00123+K00382+K00626+K14447+K01577+K00282+K00123+K01455+K00382+K00600+K11942+K14449+K11473+K00284+K11942+K00023+K01848+K00123+K00050+K01638+K00122+K01569+K14448+K00104+K00050+K14448+K00050+K00127+K01915+K00050+K01681+K00382+K03418+K14449+K17865+K00830+K00605+K01432+K11263+K11942+K00124+K01432+K03418+K01847+K00050+K01915+K00023+K00281+K00124+K00123+K00282+K00600+K00382+K00024+K01569+K00123+K00123+K01847+K00123+K00122+K14447+K00127+K00382+K00830+K07246+K11473+K05606+K00626+K00104+K00282+K18121+K01647+K07246+K00124+K01849+K00382+K01091+K00024+K00626+K01816+K00015+K00050+K11473+K11472+K03781+K01577+K00127+K00015+K11473+K01816+K00605+K01647+K00830+K00104+K01608+K01577+K01847+K01966+K01647+K03781+K00626+K00024+K01848+K00123+K00123+K01647+K00123+K00042+K01915+K00123+K01625+K00283+K00123+K00600+K11942+K01848+K01915+K00018+K00830+K00830+K00281+K00024+K01432+K00626+K00042+K01458+K01816+K01681+K01647+K14449+K01816+K00122+K01637+K00104+K11942+K05606+K00104+K00626+K00626+K00123+K00123+K00123+K01915+K14446+K00626+K01915+K01847+K00123+K01432+K00023+K00123+K00123+K01432+K01091+K01569+K01681+K01847+K01091+K07246+K01816+K01915+K01966+K01647+K00281+K00382+K01965+K14448+K08691+K14447+K18123+K00123+K00122+K11472+K00830+K01915+K11263+K00626+K14446+K00123+K01432+K00127+K00605+K01638+K14447+K00127+K00626+K01647+K05606+K00600+K00024+K00122+K00104+K01848+K01681+K01848+K00042+K07246+K11517+K00382+K11942+K01849+K00123+K01638+K01848+K00626+K14448+K01915+K00123+K11473+K00284+K01432+K00024+K01091+K00281+K00626+K00281+K01647+K01647+K00050+K01848+K14447+K00600+K00626+K11942+K00123+K01647+K01647+K01848+K00015+K00123+K01816+K00382+K01915+K01915+K00283+K00282+K01816+K14446+K00124+K01847+K00865+K00600+K01647+K00830+K00283+K01849+K01848+K00123+K00104+K00283+K01432+K01847+K00104+K01455+K01816+K00382+K00123+K01637+K18123+K03780+K00605+K00284+K07246+K01915+K00626+K01681+K00626+K00600+K00282+K02437+K01458+K11472+K00015+K00127+K01625+K01847+K14447+K01432+K00626+K00024+K00605+K14448+K00284+K11473+K00123+K01647+K00626+K01681+K01091+K11472+K01816+K00123+K11473+K00626+K00123+K01849+K01915+K03781+K00600+K00605+K03781+K00122+K00283+K01915+K00626+K01647+K14448+K18123+K01681+K00626+K01432+K00284+K00281+K00122+K01965+K01455+K01577+K05606+K11473+K11473+K00382+K01681+K00023+K01432+K08691+K03781+K00123+K02437+K01647+K05606+K00042+K00123+K01433+K00605+K07246+K00282+K01915+K11472+K11473+K00123+K00104+K01625+K01915+K03781+K01681+K00605+K03781+K00024+K00015+K00626+K14448+K08691+K00123+K01847+K01647+K00123+K01965+K00123+K00124+K00123+K05606+K03781+K00600+K08691+K01569+K00123+K00382+K00018+K00626+K00382+K00830+K00124+K00626+K00104+K01915+K01455+K00626+K14448+K00123+K01915+K01577+K00123+K00122+K01432+K11472+K14449+K00024+K01647+K00626+K01681+K03781+K01577+K00830+K00024+K03781+K00123+K01455+K07246+K00124+K14449+K11472+K00626+K00605+K03418+K00123+K00123+K00282+K00283+K01847+K00626+K11472+K01091+K01638+K11517+K00123+K00124+K00023+K00626+K00123+K00123+K11263+K01848+K00282+K02437+K00626+K00605+K01569+K02437+K01647+K00605+K03781+K01577+K00283+K01625+K00018+K01458+K03418+K00123+K00123+K00123+K00123+K00122+K01965+K00042+K00124+K00626+K00122+K00123+K00382+K00626+K01647+K12972+K01647+K00123+K01966+K01847+K00382+K11472+K01681+K03779+K00024+K00382+K01601+K00282+K01848+K01577+K00123+K00830+K00122+K00282+K01577+K03781+K01847+K01847+K01915+K00626+K01847+K01848+K00605+K01681+K03418+K00123+K01432+K00282+K01915+K00830+K11472+K00626+K00605+K00600+K00283+K00123+K01965+K01915+K01608+K01915+K01915+K03781+K01433+K07246+K00123+K01915+K01847+K11472+K11473+K00024+K01965+K00023+K01847+K01647+K00023+K05606+K00122+K01091+K00123+K01681+K11472+K01638+K01915+K05606+K00123+K01847+K11473+K02437+K00605+K01577+K00626+K00830+K01455+K01091+K01625+K01638+K00104+K11472+K00123+K01915+K11942+K01681+K01915+K01455+K01681+K00050+K00626+K00124+K14446+K01647+K01848+K05606+K00124+K00127+K05606+K00127+K00104+K01577+K01569+K00123+K00282+K01681+K03418+K01091+K00122+K00283+K00123+K11472+K00050+K03781+K11473+K14449+K00123+K00024+K00626+K01681+K00123+K01915+K01637+K00283+K00382+K00382+K00626+K01637+K01569+K11473+K00626+K00600+K07246+K00123+K01638+K01847+K00122+K00830+K01647+K00123+K00123+K01681+K01915+K01577+K00382+K00626+K00050+K00282+K00382+K00626+K00015+K01847+K01915+K00124+K01637+K01848+K00281+K00042+K05606+K07246+K00023+K01847+K00127+K00626+K00281+K01638+K08691+K00018+K00283+K00626+K00382+K00605+K01816+K00382+K00382+K11473+K01848+K00123+K00127+K01432+K11472+K00123+K00283+K00104+K00123+K00283+K01602+K01601+K00284+K00382+K01847+K00050+K00050+K01647+K00050+K01847+K00626+K00382+K01681+K00626+K00284+K00626+K01569+K00127+K00024+K11517+K03418+K00626+K11473+K01848+K00042+K01647+K01647+K01638+K01681+K11473+K01638+K01847+K01915+K14447+K05606+K00600+K01432+K01601+K00830+K01681+K00600+K01681+K11473+K00382+K00605+K01647+K07246+K01637+K00382+K00830+K03780+K05606+K00050+K00104+K00104+K00626+K01569+K01577+K00042+K00605+K01915+K11473+K00124+K00123
eggNOG

eggNOG 数据库是利用 Smith-Waterman 比对算法对构建的基因直系同源簇 (Orthologous Groups) 进行功能注释, eggNOG(v4.5)目前涵盖了2031个物种,构建了包含25个大类,约19万个直系同源簇。

目前eggNOG的最新版本为4.5,比对所用的软件为HMMER(版本:3.1b2,参数:-E 1e-5)。

结果文件在文件夹:upload/07.function/02.eggNOG下。

eggNOG注释结果表(部分展示)
gene_ideggNOG_levelBquery_startquery_endsubject_startsubject_endevalueeggNOG_levelAeggNOG_desc
gene_17ENOG4111FEB527172594e-12SNA
gene_23ENOG410ZZ1K3635658.4e-14SNA
gene_23ENOG410ZIAK1637691.9e-12SNA
gene_23ENOG410Y8DP1733756.9e-12SNA
gene_23ENOG410XXQI367741387.9e-12SNA
gene_23ENOG410ZIBW5711372031e-11SNA
gene_23ENOG410ZT20469571223.6e-11SNA
gene_23ENOG410ZRX39676644.3e-11SNA
gene_25ENOG410ZGC382668174456.2e-39Sterminase, large subunit
gene_25ENOG410ZZHJ78415974382.7e-14SNA
CAZy

CAZy 数据库是研究碳水化合物酶的专业级数据库,主要涵盖 6 大功能类:糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases ,GHs), 糖基转移酶(Glycosyl Transferases,GTs),多糖裂合酶(Polysaccharide Lyases,PLs),碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases,CEs), 辅助氧化还原酶(Auxiliary Activities , AAs)和碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules, CBMs)。 其中每一个大类有可以分类很多小的家族,比如CE1,CE2等等,注释结果中的CE0表示没有小家族分类的结果。

注释所用的CAZy的版本为:20151020,比对所用的软件为BLAST+(版本:2.2.29,参数: -evalue 1e-5)

结果文件在文件夹:upload/07.function/03.CAZy下。

CAZy注释结果表(部分展示)
gene_idgene_startgene_endidentityevaluesubject_iddescriptionCAZy_levelB
gene_3730049233.681e-12AII26857.1tail fiber protein [Staphylococcus phage MCE-2014]GH20
gene_559619434.316e-06ADM69396.1SAM-dependent methyltransferase [Paenibacillus polymyxa E681]GT0
gene_83128530.164e-20ACC56372.1Phage-related minor tail protein [Acinetobacter baumannii ACICU]GH23
gene_831524331.882e-19AHB92177.1Putative bacteriophage protein [Acinetobacter baumannii ZW85-1]GH23
gene_83928530.423e-19AIL78607.1tail protein [Acinetobacter baumannii]GH23
gene_83124330.356e-19ADX04253.1Phage-related minor tail protein [Acinetobacter baumannii 1656-2]GH23
gene_83124429.841e-18AIL75970.1phage tail length tape measure protein [Acinetobacter baumannii]GH23
gene_83224330.582e-18BAN87351.1phage tail length tape-measure protein [Acinetobacter baumannii NCGM 237]GH23
gene_83124331.102e-18BAP66338.1phage tail length tape-measure protein 1 [Acinetobacter baumannii]GH23
gene_83224330.993e-18BAN88350.1phage tail length tape-measure protein [Acinetobacter baumannii NCGM 237]GH23
功能注释统计

综合各个数据库的注释结果,分别统计其注释基因个数及比率,然后绘制柱状图和韦恩图,并生成基因注释总表。

结果文件在文件夹:upload/07.function下。

基因注释结果统计表
DatabaseAnnotated gene numberAnnotated ratio(sum 223045 genes)
KEGG16364073.37%
eggNOG16658474.69%
CAZy191448.58%


功能注释基因柱状图 功能注释基因韦恩图


基因注释总表(部分展示)
GENEIDG1G2G3BLlengthscaftigs_idstartendstrandtaxonomykegg_desc(bestHit)kegg_anno(classA:classB:classC)seggNOG_anno(classA)sCAZy_anno(classB)s
gene_174.439700.09930.234141G1_0000012142-----------
gene_2106.17160.92961.80090.6931909G1_0000013671275-----------
gene_3108.58720.12540.30280.2691327G1_00000112781604-----------
gene_4111.34991.79941.4081.0277723G1_00000116162338-----------
gene_5104.6971.82031.61470.6061462G1_00000123422803-----------
gene_698.22490.8790.96380.32823513G1_00000128036315-----------
gene_788.46730.34270.06230.1184321G1_00000163156635-----------
gene_894.65490.48120.08920426G1_00000166367061-----------
gene_982.54840.02150.16130.172279G1_00000170587336-----------
gene_1096.74473.02432.75282.41131359G1_00000173338691-----------
功能注释结果分类分析

根据基因在各个数据库中的分类信息,统计各个数据库各个分类上注释的基因数,然后绘制柱状图。 其中,KEGG统计B级分类上的注释结果,eggNOG统计A级分类上的注释结果,CAZy统计A级分类上的结果。

结果文件在文件夹:upload/07.function下各自数据库的子文件夹下。

  • KEGG
  • eggNOG
  • CAZy

说明:图中X轴为注释上基因的数量,图中Y轴为Pathway的分类信息,其中黑色部分为A级分类,有颜色的部分为B级分类,图中没有展示的分类说明其注释到的基因个数为0。

说明:X轴是NOG的A级功能分类,对应不同的颜色,每类功能的详细说明见右侧的图例;Y轴是注释上基因的个数。

说明:X轴是CAZy的A级功能分类,对应不同的颜色,每类功能的详细说明见右侧的图例;Y轴是注释上基因的个数。

功能丰度分析

根据基因在各个数据库中的分类信息,结合基因在各个样品中的丰度表,可以得到各数据库在不同层级上的相对丰度信息。 其中,KEGG 分为三个层次(第一层为生物代谢通路,第二层为子功能,第三层为代谢通路图), eggNOG 分为三个层次(第一层为二级功能分类,第二层为功能描述,第三层为 eggNOG 编号), CAZy 共分为两个层次(第一层为六大功能类,第二层为子功能)。

利用各数据库第一层级(A级)的相对丰度表,绘制出各个数据库中,各样品对应的在第一层级上的统计图。

结果文件在文件夹:upload/07.function下各自数据库的子文件夹下。

  • KEGG
  • eggNOG
  • CAZy

说明:X轴为样品名,Y轴为相对丰度,图中不同的颜色块对应KEGG的第一层级分类,详见右侧的图例说明。

说明:X轴为样品名,Y轴为相对丰度,图中不同的颜色块对应的eggNOG第一层级分类,详见右侧的图例说明。

说明:X轴为样品名,Y轴为相对丰度,图中不同的颜色块对应的CAZy第一层级分类,详见右侧的图例说明。

功能丰度热图

根据所有样品在各个数据库中的功能注释和丰度信息,选取丰度排名前35的功能及他们在每个样品中的丰度信息绘制热图 (KEGG 选取第二层级进行展示,eggNOG 选取第三层级进行展示,CAZy 选取第二层级进行展示), 并从功能和样品两个层级进行聚类。

结果文件在文件夹:upload/07.function下各自数据库的子文件夹下。

  • KEGG
  • eggNOG
  • CAZy

说明:X轴为样本名,Y轴为KEGG二级分类。

说明:X轴为样品名,Y轴为eggNOG第三层级分类。

说明:X轴为样品名,Y轴为CAZy第二层级分类。

多样品间比较分析

物种PCA分析

根据各个样品中各个物种分类的丰度信息,进行PCA分析,从而判断样品之间的分类关系。这里选取门水平上的丰度信息来进行PCA分析。

结果文件在文件夹:upload/05.taxonomy/profiling下。

说明:横坐标表示第一主成分,百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值;纵坐标表示第二主成分,百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值;图中的每个点表示一个样品,同一个组的样品使用同一种颜色表示。

门水平上的物种分类PCA分析
功能PCA分析

根据所有样品在各个数据库中的功能注释和丰度信息,选取全部某级功能分类中全部的分类及他们在每个样品中的丰度信息,先对每个分类在各个样品中的数据进行Z值均一化, 然后再进行PCA分析(KEGG 选取第二层级进行,eggNOG 选取第三层级进行,CAZy 选取第二层级进行)。

结果文件在文件夹:upload/07.function下各自数据库的子文件夹下。

说明:横坐标表示第一主成分,百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值;纵坐标表示第二主成分,百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值;图中的每个点表示一个样品,同一个组的样品使用同一种颜色表示。

  • KEGG
  • eggNOG
  • CAZy

KEGG第二层级PCA分析

eggNOG第三层级PCA分析

CAZy第二层级PCA分析

物种聚类分析

根据所有样品在某个分类水平上的相对丰度信息,我们可以计算样品间的Bray距离,然后根据Bray距离进行分层聚类,这样可以判断样品在门分类水平上的相似性。 同时为了便于理解,将门水平上的物种分类堆叠图与Bray距离的聚类结果结合在一起展示。

结果文件在文件夹:upload/05.taxonomy/profiling下。

说明:图中左侧为所有样品在门水平上的Bray聚类分析结果,右侧为门水平上(取相对丰度前10的门)的堆叠图。

门水平上的Bray聚类分析及物种组成堆叠图
功能聚类分析

根据所有样品在各个数据库A级分类水平上的相对丰度信息,我们可以计算样品间的Bray距离,然后根据Bray距离进行分层聚类, 这样可以判断样品在门分类水平上的相似性。同时为了便于理解,将A级功能分类堆叠图与Bray距离的聚类结果结合在一起展示。

结果文件在文件夹:upload/07.function下各自数据库的子文件夹下。

  • KEGG
  • eggNOG
  • CAZy

说明:图中左侧为所有样品在KEGG一级分类水平上的基因丰度Bray聚类分析结果,右侧为其堆叠图。

说明:图中左侧为所有样品在eggNOG一级分类水平上的基因丰度Bray聚类分析结果,右侧为其堆叠图。

说明:图中左侧为所有样品在C一级分类水平上的基因丰度Bray聚类分析结果,右侧为其堆叠图。

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