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sanger测序作为测序界的金标准,还是需要会的

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发表于 2017-3-1 16:55:53 | 显示全部楼层 |阅读模式
高通量测序最近这几年很火越来越火,但是世界上更多的还是一帮天天做分子克隆、养细胞、养细菌、杂蛋白的生物学家,究其原因Sanger测序还是测序届的金标准,由于精确度高于2、3代测序且保持大白菜价格使之地位稳固,那么我们就来看看普及率最高的一代测序分析中出现的一些情况及解决方案:
1.测序结果不到800Bases是什么原因?
(1)G/C rich、G/C Cluster。
这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失(图1,图2)
如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的测序反应能保证达到800Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象,出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。


图1 GC引起的信号减弱

图2 G/C rich引起的信号消失
(2)A、T的Poly结构
    这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰。根据文献记载。原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢?现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。一般来说,PCR片段直接测序时,A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。

图3 polyA引起的套峰
(3)原因不明的复杂结构,测序结果出现突然信号减弱或消失
从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。


图4 复杂结构引起的信号中断  
2.出现套峰是什么原因?
在测序反应中,模板或引物的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点:
(1)测序引物在模板上有两个结合位点(图5);
(2)模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆(图6),如果是PCR,原因为非特异性条带(图7);
(3)模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等(图8);
(4)引物降解,或引物不纯(图9,图10)。



图5 双引物结合位点引起的套峰  

图6 由于质粒或菌液为非单克隆引起的套峰  


图7 PCR为非特异性条带引起的套峰  

图8 模板特殊结构引起的套峰

图9 引物轻微降解或引物不纯引起的套峰


图10 引物严重降解或引物不纯引起的套峰  
解决方案汇总
1.样品测序无信号
可能是引物结合位点不存在或被破坏;建议更换引物测序或重新提供样品测序。
2.样品测序信号差
可能是引物或模板的质量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的,也可能是样品浓度偏低;建议提供高质量样品测序。
3.样品测序衰减
可能是由于特殊结构如Poly结构、重复序列、回文结构、发卡结构、GCrich、AT富集等导致的测序衰减,由于是样品本身结构问题无法优化建议反向测序进行拼接以得到完整序列,还有一种衰减的情况就是在一段正常峰型后逐渐衰减,可能是模板量反应量不足导致,建议制备高浓度模板测序。
4.样品测序套峰
套峰细分的话有如下几种情形:
①全双峰:多引物结合位点(针对菌液、质粒样品),非特异性扩增(针对PCR产物);
②前双峰:多引物结合位点,其中一套模板测序中断(针对菌液、质粒样品),多引物结合位点(PCR未纯化样品),引物二聚体或小片段干扰(针对PCR已纯化样品);
③中间双峰:非单克隆(针对质粒、菌液样品),碱基缺失或等位基因双模板(针对PCR未纯化样品);
④后双峰:非单克隆(针对菌液、质粒样品),碱基缺失(针对PCR样品);
针对二聚体及小片段干扰的情况建议电泳切胶回收纯化;针对多引物结合位点的情况建议更换引物测序或反方向测通样品;针对碱基缺失建议克隆测序;针对非单克隆建议在克隆无误的前提下重新挑取单克隆测序;针对非特异性扩增建议优化反应条件重新制备样品测序;针对等位基因双模板建议克隆测序。
5.样品测序中断
可能样品存在特殊高级结构,导致dNTP和ddNTP在某一碱基位点后无法与模板结合,测序酶无法继续延伸,建议使用反向引物进行测序经拼接后可以得到完整序列;或酶切后亚克隆测序。
6.样品测序移码
测序从开端发生移码可能是引物发生降解,建议重新提供引物;测序局部出现移码,可能样品存在特殊高级结构,建议反向测通。
7.样品测序底峰干扰
可能测序引物不纯,建议将引物进行PAGE胶纯化后在进行测序或重新提供引物测序;可能测序样品不纯,混有正、反向引物,建议重新制备样品测序。




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