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[mRNA-seq] 如何解决cuffdiff运行结果中表达量为0的情况?

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发表于 2017-3-10 10:39:48 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 AdaWon 于 2017-3-10 10:46 编辑

Cuffdiff problem___Performed 0 isoform-level transcription difference tests

[Bash shell] 纯文本查看 复制代码
cuffdiff -o ${cfdiff_dir} -b $ref_fa -u -p 30 -T --library-type fr-firststrand \
-L X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9 ${cfmerge_dir}/merged.gtf \
X1_R1/accepted_hits.bam,X1_R2/accepted_hits.bam,X1_R3/accepted_hits.bam \
X2_R1/accepted_hits.bam,X2_R2/accepted_hits.bam,X2_R3/accepted_hits.bam \
X3_R1/accepted_hits.bam,X3_R2/accepted_hits.bam,X3_R3/accepted_hits.bam \
X4_R1/accepted_hits.bam,X4_R2/accepted_hits.bam,X4_R3/accepted_hits.bam \
X5_R1/accepted_hits.bam,X5_R2/accepted_hits.bam,X5_R3/accepted_hits.bam \
X6_R1/accepted_hits.bam,X6_R2/accepted_hits.bam,X6_R3/accepted_hits.bam \
X7_R1/accepted_hits.bam,X7_R2/accepted_hits.bam,X7_R3/accepted_hits.bam \
X8_R1/accepted_hits.bam,X8_R2/accepted_hits.bam,X8_R3/accepted_hits.bam \
X9_R1/accepted_hits.bam,X9_R2/accepted_hits.bam,X9_R3/accepted_hits.bam 


运行报告:
...........> Processing Locus SL3.0ch12:68091938-68124245 [************************ ]  99%
> Processed 31016 loci.                        [*************************] 100%
Performed 16 isoform-level transcription difference tests
Performed 16 tss-level transcription difference tests
Performed 16 gene-level transcription difference tests
Performed 0 CDS-level transcription difference tests
Performed 0 splicing tests
Performed 0 promoter preference tests
Performing 0 relative CDS output tests
Writing isoform-level FPKM tracking
Writing TSS group-level FPKM tracking
Writing gene-level FPKM tracking
Writing CDS-level FPKM tracking
Writing isoform-level count tracking
Writing TSS group-level count tracking
Writing gene-level count tracking
Writing CDS-level count tracking
Writing isoform-level read group tracking
Writing TSS group-level read group tracking
Writing gene-level read group tracking
Writing CDS-level read group tracking
Writing read group info
Writing run info

PS:
另外,cufflinks 中基因的表达量正常,不为0;
请问,为什么会出现这种情况?有哪些情况可能导致这个情况的出现?有没有比较好的解释或解决办法?欢迎大家交流讨论。
相关链接:
http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=26711
http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=12366




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发表于 2017-3-10 10:52:56 | 显示全部楼层
你这个问题,问的很有诚意,我没有做过,但是给你顶一下,不过我记得群主说过这些tophat+cutflinks软件都过时了,考虑用hisat2+htseq-counts吧
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 楼主| 发表于 2017-3-10 13:19:44 | 显示全部楼层
ydchen 发表于 2017-3-10 10:52
你这个问题,问的很有诚意,我没有做过,但是给你顶一下,不过我记得群主说过这些tophat+cutflinks软件都过 ...

谢谢啦!其实我也看到群主说过这些tophat+cutflinks软件都过时这个说法了,但是,我觉得这是我遇到的问题,我还是蛮希望能够知道为什么?以及如何解决?而且这套软件引用率这么高,很有可能别人也遇到过;另外新的处理流程确实值得尝试,但是我觉得应该有个对比,因为有的流程只是拿人类基因组做数据集分析,并不意味者一定对其他物种也能达到理想的状态,尤其是很多物种的注释不如人类基因组那么完整,这种情况下的选择更需要慎重和尝试。
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发表于 2017-3-18 20:47:36 | 显示全部楼层

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请问如果要对一种癌症进行分析,共有30个病人的正常细胞的数据和癌症细胞的数据 那么使用cuffmerge合并转录本时,是将所有正常细胞的数据和癌症细胞的gtf的路径都放在list.txt中吗?
还有就是使用cuffdiff时应该如何输入bam文件,是否是将bam文件分为N(正常)和Ca(癌症)两组,在-L参数后写N Ca即可
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 楼主| 发表于 2017-3-18 21:42:31 | 显示全部楼层
zyz 发表于 2017-3-18 20:47
请问如果要对一种癌症进行分析,共有30个病人的正常细胞的数据和癌症细胞的数据 那么使用cuffmerge合并转录 ...

按照我的理解应该就是你说的这样。
cuffmerge 所有的BAM文件,作为下游cuffdiff 的参考注释文件,
-L N,ca \
N_R1.BAM, N_R2.BAM,N_R3.BAM \
ca_R1.BAM, ca_R2.BAM,ca_R3.BAM \
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发表于 2017-8-19 14:53:09 | 显示全部楼层
请教楼主一个问题,最近也在用tophat和cufflinks,但是生成的diff_out文件在readcufflinks之后,都是0,是之前步骤出问题了吗
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 楼主| 发表于 2017-8-20 17:52:13 | 显示全部楼层
生信小小菜鸟 发表于 2017-8-19 14:53
请教楼主一个问题,最近也在用tophat和cufflinks,但是生成的diff_out文件在readcufflinks之后,都是0,是之 ...

我遇到过这样的问题,检查之前的步骤,没有问题的话,就重新运行cuffdiff这一步,有时候重新运行出来的结果就正常了,所以我猜测可能是计算资源不够导致的,但仅限于猜测,具体原因我也不知清楚
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发表于 2017-10-1 11:00:51 | 显示全部楼层
AdaWon 发表于 2017-8-20 17:52
我遇到过这样的问题,检查之前的步骤,没有问题的话,就重新运行cuffdiff这一步,有时候重新运行出来的结 ...

谢谢你的回答,之前输出为零是因为没有重复,只是将对照和处理各一个进行处理。
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发表于 2018-7-31 09:47:06 | 显示全部楼层
您好,请问如果每个病人只测了一组正常组织与癌症组织,测了30个病人,那么还需要cuffmerge吗
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