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研究RNA的实验技术

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发表于 2017-4-19 14:37:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
一般来讲我们需要知道RNA的以下信息:

RNA的完整性
RNA的长度、序列
RNA在细胞、组织的差异变化
RNA在细胞中的分布
RNA在基因组上的定位
RNA的时空变化


(一)RNA的完整性
技术:琼脂糖凝胶电泳
分离完整的RNA在基因表达分析所用的众多技术中是必不可少的,但是RNA抽提过程中,机械力的作用下,较长的RNA容易断裂、降解,完整性差的RNA抽提物不利于下游的分析实验。
完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带(真核样品)。28S rRNA条带的强度应当大致为18S rRNA条带的两倍(图1,第3条泳道)。这种2:1的比率(28S:18S)是判断RNA完整性的一个很好的指标。


(二)RNA的长度、序列
技术1:普通PCR、一代测序
如果知道目标RNA的5’端序列,设计引物对mRNA、ncRNA进行反转录,PCR扩增后,去测序,便可以知道准确的序列和长度,这种最简单了,这种测序一次性最多保证测700bp。

技术2:RACE
经典的RACE技术是通过RT-PCR技术,由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端,包括单边PCR和锚定PCR。


(三)RNA在细胞、组织中的差异变化
技术:DNA芯片、二代高通量测序、Q-PCR
病灶组织和病灶周围组织的小RNA、ncRNA的丰度变化,有助于疾病的研究,可以通过核酸芯片或者二代高通量测序RNA-seq。
自二十世纪九十年代中期以来,芯片就一直是基因组表达分析的中坚力量。在这一技术最辉煌的时期,准备研究基因表达模式的人都会想到使用芯片。不过随着测序成本的直线下降,RNA测序(RNA-seq)成为了越来越受欢迎的转录 组分析方法。
DNA芯片上排列着大量的核酸探针,可以代表生物的整个基因组或转录组,比如miRNA、circRNA等等。用芯片分析基因表达需要抽提RNA,将其反转录为cDNA,然后进行荧光标记。芯片上各点的信号强弱,代表了该探针目的基因的表达量。



高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条cDNA分子进行序列测定,又被称为深度测序(deep sequencing)。
所以你对病灶组织和病灶周围组织的ncRNA做二代测序,再生信分析后,会看到病灶组织中有一部分RNA丰度上调,有一部分RNA丰度下调,再结合有关数据库,集中在几个RNA进行后续研究,有必要的话用Q-PCR再次确认丰度变化的结果。



(四)RNA在细胞中的分布
技术:RNA原位杂交(RNA in situ hybridization)
因为RNA可以在转录水平、转录后水平参与调控作用,其既可以在胞核也可以在胞浆甚至胞外发挥功能。那么RNA的分布也是研究者所关心的问题,这个问题可以用RNA原位杂交顺便来研究。另外,如果RNA能与蛋白结合并改变蛋白定位,那么就可以借助ISH来研究蛋白定位。
原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。根据RNA序列设计cDNA、cRNA探针,对目标进行定位。


(五)RNA在基因组上的定位
技术:原位杂交(Fluoresence in situ hybridization)
原理同上,只不过这次探针结合的不是RNA,变成细胞核中的染色体上的染色质上的DNA序列,这可以反映RNA的原始基因组位点。


(六)RNA的时空变化
技术:EU RNA标记技术
EU是一种尿嘧啶核苷类似物,含有在天然化合物中很少见的炔羟基团,EU分子很小,容易在细胞内自由扩散,不需要严格的样品处理,能够插入正在转录的RNA分子中,基于EU与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析,能够在组织、器官的整体水平上准确观察RNA转录的真实情况,能够更方便地研究RNA转录位点,结合相关抗体标记能够检测与RNA有相互作用的蛋白。



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