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用NET-seq看RNA聚合酶的行为

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发表于 2017-5-1 21:08:19 | 显示全部楼层 |阅读模式
NET-seq(native elongating transcript sequencing)

当Matt Larson还是斯坦福大学的一名研究生时,他就对RNA聚合酶的奇怪行为很感兴趣。

尽管在细胞中起着关键作用,但RNA聚合酶在产生RNA转录本时停停顿顿,经常休息。
“RNA聚合酶的暂停在不同的生物中特别保守,”Larson谈道。“与速度快10倍的DNA复制不同,转录过程经过演化,使得RNA聚合酶暂停识别特定序列,这表明这种暂停在调控基因表达中扮演了关键角色。”

转录暂停帮助调整转录本的外观,也影响基因表达。
但在大多数情况下,这些暂停并没有与特定的功能相关联。尽管它们在体外被研究,但体内暂停的决定因素以及在整个细菌基因组中的分布仍不清楚。

Larson已经利用单分子光学捕获技术来研究大肠杆菌RNA聚合酶的转录暂停,但他希望将这些数据与高分辨率的RNA聚合酶动力学视图相比较,以确定这些暂停是否在调控基因表达中发挥了明显作用。
为了实现这一点,他与威斯康辛大学的Robert Landick合作,转向一种称为NET-seq(native elongating transcript sequencing)的方法1。大约在同一时间,另一个独立的研究小组,罗格斯大学的Richard Ebright和Bryce Nickels,也开始了类似的研究。

暂停普遍存在

基于RNA聚合酶高度密集的DNA位点表示停顿的前提,NET-seq以单核苷酸分辨率定位RNA聚合酶的占有水平,从而鉴定暂停位点。
“与NET-seq最接近的技术是RNA-seq,它将所有RNA从细胞中分离出来,以确定哪些基因活跃表达。这包括成熟的转录本以及仍在被合成的转录本,”Larson解释道。“对于NET-seq,只有正在被合成的转录本被分离出来,让我们能了解那些可能被错过的不稳定转录本。”
Larson及其合作者利用NET-seq,鉴定出大肠杆菌中16个核苷酸的共有暂停序列,以及大约2万个新发现的暂停位点,表示平均每100 bp中就存在一个暂停位点2。“我们惊讶地看到,这个基本的序列特异性相互作用导致了整个基因组的普遍暂停。在研究任何一组特定基因或通路时,这些新发现的暂停位置无疑将成为其他科学家的资源,”Larson说。
Landick补充道:“这些结果将为了解转录调控机制提供新的见解。它们也将对合成生物学有重要意义,基因设计者可能希望避免暂停序列,或将它们放在特定位置,以影响基因表达。”

协调和保守

Larson及其合作者发现,RNA聚合酶倾向于在所表达基因的前100个核苷酸内暂停,这有可能限制其他RNA的合成,直至核糖体可以开始翻译。此外,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的翻译起始位点都充满了共有序列。这一发现“完全出乎意料,也表明[暂停位点]发挥着重要的调控作用,”Larson谈道。
据Roberts介绍,一个可能的调控机制在于核糖体结合序列的接近。“由于核糖体结合位点在物理上被暂停的RNA所遮蔽,一旦RNA聚合酶停留在暂停位点,暂停可能实现了准备RNA进行翻译的某些过程。”
研究人员发现,共有序列导致不同谱系的RNA聚合酶暂停,甚至是哺乳动物RNA聚合酶II。这表明,共有序列暂停可能在原始生物的早期进化,随后被指派来控制各种调控背景下的转录,这也解释了如今观察到的转录暂停的多种功能。

有趣的相互作用

在一项独立研究中,Ebright、Nickels及其同事利用NET-seq来定义大肠杆菌中暂停的关键序列决定因素3。研究人员鉴定出15,000多个暂停位点,并通过比对这些序列,他们鉴定出明确的暂停诱导序列元件。
Ebright及其团队之前已经表明,RNA聚合酶与核心识别元件(CRE)存在相互作用,而且这种相互作用对转录起始很重要。为了探索这种相互作用在暂停中的作用,Ebright和Nickels构建了一种突变的RNA聚合酶,它在识别CRE上有缺陷,并开发出NET-seq的一个变种,称为merodiploid NET-seq(mNET-seq),这实现了突变RNA聚合酶的分析。
令他们吃惊的是,破坏RNA聚合酶和CRE之间相互作用的一个替换增加了体内和体外的暂停。“当我们开始工作时,我们预计RNA聚合酶与CRE之间的相互作用导致暂停。这些数据让我们的想法有了180度的转变,”Ebright说。
Ebright的研究小组接着确定RNA聚合酶与CRE之间的序列特异性相互作用通过哪种机制抵消暂停,表明这些相互作用的主要功能可能是抑制转录暂停过程中的噪音。
展望未来,研究人员将继续扩大RNA聚合酶突变体的工具箱,以检验RNA聚合酶与CRE之间相互作用在其他关键的转录过程中的作用,他们将分析真核生物RNA聚合酶II的序列依赖性暂停。他们也想鉴定其他的DNA序列或RNA聚合酶与DNA之间的其他相互作用,可能影响这些位点的暂停。
但就目前而言,这一领域仍被一个关键问题所困扰,那就是:“整个基因组中有数千个暂停位点,它们的功能作用是什么,如果有的话?”

参考文献
1. Churchman LS, Weissman JS. 2011. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature 469(7330):368-73. doi: 10.1038/nature09652.
2. Larson MH, Mooney RA, Peters JM, Windgassen T, Nayak D, Gross CA, Block SM, Greenleaf WJ, Landick R, Weissman JS. 2014. A pause sequence enriched at translation start sites drives transcription dynamics in vivo. Science 344(6187):1042-7. doi: 10.1126/science.1251871. Epub 2014 May 1.
3. Vvedenskaya IO, Vahedian-Movahed H, Bird JG, Knoblauch JG, Goldman SR, Zhang Y, Ebright RH, Nickels BE. 2014. Interactions between RNA polymerase and the "core recognition element" counteract pausing. Science 344(6189):1285-9. doi: 10.1126/science.1253458.
4. Roberts JW. 2014. Molecular basis of transcription pausing. Science 344(6189):1226-7. doi: 10.1126/science.1255712.



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