搜索
查看: 2377|回复: 0

T细胞受体库,对肿瘤免疫研究

[复制链接]

365

主题

512

帖子

1713

积分

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
1713
发表于 2017-5-15 11:18:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
研究背景
使用新一代测序方法(NGS)对T细胞受体(TCR)库进行测序是进一步深入了解适应性免疫系统的一种重要工具。随着免疫疗法(特别是T细胞疗法)在治疗癌症方面的潜力越来越大,详细、客观地了解TCR库的能力成为生物标志物发现、治疗免疫应答和肿瘤微环境研究的必要条件。该领域试图解答的一个关键问题是肿瘤部位的循环T细胞与浸润性T细胞之间的关系。

研究方法
在此,我们提出了一种使用Ion Torrent S5测序仪对TCR库测序的新型AmpliSeq方法。这种方法具有简化的工作流程,并能够提供高达600 bp的读长,因此可以对TCRβ的整个V(D)J区域进行更完整的鉴定。


该方法具有独特的长读长功能,能利用mRNA作为起始材料,最大限度地减少了起始材料需求(标准用途为10-500ng)。该AmpliSeq方法靶向测序恒定(C)区和FR1区,与仅鉴定征CDR3区域的技术相比,可最大程度降低引物偏差概率,大大增加系统发育信息含量。

我们的研究结果表明,循环T细胞库的大小比浸润性T细胞库大2个数量级左右。因此,尽管完整的循环T细胞库因其极为多样化而难以完全捕获,但我们发现可以通过在Ion 530芯片上同时检测多达10个样品而可靠捕获完整的浸润性T细胞库。浸润性T细胞重复运行的相关性可达到0.9左右,表明结果具有可重复性,并且对样品实现了适当的深度测序。

总之,我们认为这种高度多重工作流程和快速出结果时间(从RNA到获得结果所需时间小于48小时)将使浸润性T细胞库的鉴定成为更常规性的工作,并使该领域研究人员能够更好地认识TCR库多样性对肿瘤消除的影响。



图1. 经过V(D)J重排,COR1、2和3区以及骨架(FR1、2和3)区鉴定的T细胞受体构造示意图。使用RNA/cDNA作为起始材料,实现靶向(V)和(C)区域的引物设计。

研究结果
Oncomine™ TCR-Seq β Assay利用AmpliSeq™文库构建以设计靶向FR1区域的引物,同时包含对所有已知(V)区域重排设计的引物。所构建的测序文库通常为325-350bp。AmpliSeq™工作流程只需30分钟手动操作时间,并且可在5小时内完成文库构建。




图2.在S5-530芯片上运行Oncomine™ TCR-Seq P检测生成的文库的测序读长直方图。当运行通过我们的分析途径时,总读数通常为15-20M,其中70-80%是“有效的”(蓝色+浅蓝色)。

Oncomine TCR-Seq β Assay可在Ion S5TM 530芯片上测序使用。对于库大小有限的样品(培养细胞、组织),这种测序方法在每张芯片上可对最多16个样品进行同时测序。这种多重能力还能够实现包含样品比较的测序运行,即在同一次测序中同时运行组织和血液样品(图4-6)。图3描绘了对来自非小细胞肺癌(NSCLC)活检的10个新鲜冷冻肿瘤润性白细胞(TIL)样品进行重复测序的关联图。被识别克隆之间的高度一致性(95.8-99.6%)表明测序深度适当。


图3. 在530芯片上对10个FF肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)样品(NSCLC)进行测序。我们通过对比重复测序结果,发现被识别克隆之间具有高度一致性(95.8-99.6%),这表明测序深度适当。

使用Ion Torren测序进行的免疫组库测序包含完整的分析套件,得到了高度准确的克隆型群体分配。库测序对碱基识别(替换)测序错误很灵敏,能够模仿库中的自然变异,使纠错策略非常难以实现。

Ion Torrent测序具有非常低的替换错误率,所产生的错误主要来自于InDel错误。这种错误类型可通过以mRNA作为检测起始样品的检测方法进行校正,操作方法:所有读数编码为有效的氨基酸序列,InDel错误作为阅读框移位错误。这种处理方法可以简化对测序错误的识别,并且在大多数情况下可以纠正错误,使每个样本的有效读数率升高。

Oncomine TCR-Seq β检测可在Ion S5™ 530芯片上进行测序。对于库大小有限的样品(培养细胞、组织),这种测序方法在每张芯片上可对最多16个样品进行同时测序。这种多重能力还能够实现包含样品比较的测序运行,即在同一次测序中同时运行组织和血液样品(图4-6)。

为测试检测方法区分样本类型的能力,从1B期鳞状细胞肺癌个体的外周血白细胞(PBL)和新鲜冷冻肿瘤活检样本中提取总RNA。在单个Ion 530™芯片上,使用来自每个样品的100ng总RNA作为TCRβ测序的模板输入。本研究的结果如图4所示;对肿瘤活检样本的测序发现了589个特有的TCR克隆——一个具有少量优势克隆的寡克隆库,得到香农多样性指数为6.78。PBL测序得到45305个特有的TCR克隆。




图4.在一个530芯片上对NSCLC患者的FF肿瘤浸润白细胞和外周血白细胞样品进行测序的概述图。

接下来,我们开展了相关性研究,以确定哪些克隆种群是肿瘤活检样本或PBL特有的,以及哪些克隆种群是两种样本类型共有的。相关性数据如图5和图6所示。


图5. V-基因引物使用和CDR3长度的谱型图,对比了P6L特有的TCRp克隆(左图—占所有被识别克隆的91.78%)以及PBL和肿瘤库共有的TCRp克隆(右图—占所有被识别克隆的8.22%)。圆圈大小代表克隆扩增水平。

图5为V-基因引物使用和CDR3长度的谱型图,分为2个窗口:左图)PBL特有的克隆,右图)PBL和肿瘤活检样本共有的克隆。从谱型图上可快速查看PBL特有克隆与共有克隆种群的区别。也就是说,相对简单的肿瘤活检样本库具有更少、更高度扩大的克隆,通过与之进行比较,得到PBL库的预期大小和多样性。



图6. 图5所示数据的关联图。x轴代表PBL特有的克隆,y轴代表肿瘤活检样本特有的克隆,同时219个克隆为PBL和肿瘤共有。

图6将同一数据分为三个自然群体;x轴代表PBL特有的克隆,y轴代表肿瘤活检样本特有的克隆,对角线代表两种样品类型共有的克隆。该图可快速识别具有进一步实验价值的克隆群体,例如,在血液中对实体瘤中鉴定的克隆进行追踪,或者对仅在肿瘤样本中发现的肿瘤进行扩增。



上一篇:TRACERx计划对NSCLC分析笔记
下一篇:全球首个万人晚期癌症测序成果发布
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ|手机版|小黑屋|生信技能树 ( 粤ICP备15016384号  

GMT+8, 2020-3-31 17:41 , Processed in 0.032617 second(s), 25 queries .

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.