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肿瘤克隆演化分析是在做什么?

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发表于 2017-6-7 17:41:08 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 ydchen 于 2017-6-7 17:44 编辑

什么是克隆演化
克隆演化(clonal evolution)是一个癌症研究中的经典模型,它不仅反映了癌细胞的异质性,更重要的是可以解释清楚不同异质性克隆之间的关系。如果我们把人体所有细胞想象成一个种群,每个细胞是一个个体,那么我们就可以在同一个人体内观察细胞群体中达尔文进化论中提到的优胜劣汰了。下面我们来设想以下过程:

(1)正常细胞某个基因突变,导致这个细胞在整个群体的竞争力猛增;
(2)此细胞建立了一个最初的克隆,而且此克隆一边增长,一边发生着基因变异;
(3)某个细胞长途跋涉,开荒种地,生儿育女,形成了新的克隆。如果画成示意图,就可以变成下面这样:



这个癌细胞演化路线实际上就是一个进化树。如果在研究中,能画出这个树,则可以观察一个人体内的不同克隆发生的时间顺序。如果能与临床数据或用药对应起来的话,可以很清楚地解释癌症发展的一些机制,例如,不同病例的原始克隆有什么相似的地方?发生克隆演化时有哪些基因参与?哪些克隆在用药后参与了耐药和复发?……

如何进行克隆演化分析
如何去构建这个进化树呢?最直截了当的办法当然是在一团肿瘤中随机抽样,把单细胞取出来去测序并构建进化关系。有许多文章就是这么做的,例如Navin(2011)和Wang(2014)。但是,使用单细胞去研究肿瘤克隆演化有几个问题。第一,单细胞非常难收集,而做演化研究又需要取得大量单细胞才有意义;第二,受到采样的限制,单细胞测序很难反映整个癌症的异质性全貌,有些克隆将无法被检测到。不过没有关系,通过测一团细胞的混池,甚至是测cfDNA,通过突变频率去推测克隆也是可行的。

举个栗子,最初的克隆携带了一些体细胞突变(标为红色),在其中某个细胞发生转移后,这个细胞上携带的特有突变(标为蓝色、紫色)就变成了这个亚克隆共有的特征。这时,如果我们统计每一个体细胞突变的频率(右图),可以发现,所有同一个癌细胞的后代可以聚为一个主克隆(红色)以外,亚克隆内将拥有相似的体细胞突变频率,这些体细胞突变是从转移的细胞身上带来的。


注:真实情况下,体细胞突变基本不可能纯合,因为突变同时发生在同一个碱基位置两次的概率极小。因此主克隆的突变频率集中在50%附近。

说到这里,应该可以看懂大多数文献里的插图了。例如,Ding(2012)是一篇发表在nature上研究白血病克隆演化的比较经典的文章,其中fig2b如下:


这张图中,横坐标和纵坐标是初诊样本和复发样本中体细胞突变频率。图上每一个点就是一个突变,对应两份样本的突变频率。通过聚类,可以发现5个明显的聚类,代表5个克隆。灰色的是主克隆,在初诊和复发几乎占全部的比重(为啥是50%左右上面有解释)。另外,红色的克隆只存在于复发,紫色只存在于初诊,黄色在复发中频率稍高于初诊,橙色在复发中的频率远高于初诊。在克隆的所有数值中取中值,就可以画出下面的图,是不是很直观。


分出来克隆以后,当然也可以去做进化树。Gibson(2016)对98例子宫内膜癌肿瘤活检组织进行了全外显子组测序,并结合了TCGA的数据,通过进化分析发现不同样本间存在共同的祖先克隆,展示了该癌症的同质性。在做进化分析时,首先使用了ABSOLUTE软件计算出样本中的癌细胞比例(cancer cell fraction,CCF),这相当于体细胞突变乘以2。如下。

接着,对每个克隆基于关系矩阵的距离法进行聚树,得到下面的进化树。这是两个样本(EC-008和EC-012)不同克隆的演化关系。在演化每一步都标出了新发生的突变。


克隆演化分析相关软件
最后来谈谈做类似工作的软件。早期的软件是不能把CNV这种变异用作聚类的,大多是直接排除掉发生在CNV区域上的突变,防止造成频率计算的误差。随着算法的更新,现在已经可以使用CNV来进行聚类分析。Jiang(2016)等介绍并比较了构建肿瘤演化关系的软件,顺便推了一下他们自己开发的软件Canopy,可以在估计出克隆以后直接给出进化树,并对进化树的可信度进行评估。感兴趣的同学可以在研究中试一试。



参考文献:
Navin N E, Kendall J, Troge J, et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing[J]. Nature, 2011, 472(7341): 90-94.
Wang Y, Waters J, Leung M L, et al. Clonal Evolution in Breast Cancer Revealed by Single Nucleus Genome Sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.
Ding L, Ley T J, Larson D E, et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing[J]. Nature, 2012, 481(7382): 506-510.
Gibson W J, Hoivik E A, Halle M K, et al. The genomic landscape and evolution of endometrial carcinoma progression and abdominopelvic metastasis.[J]. Nature Genetics, 2016, 48(8): 848-855.
Jiang Y, Qiu Y, Minn A J, et al. Assessing intratumor heterogeneity and tracking longitudinal and spatial clonal evolutionary history by next-generation sequencing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(37).





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