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血液-血浆-PBMC

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发表于 2016-9-14 14:43:21 | 显示全部楼层 |阅读模式
不少测序数据的来源样本,就是血液,所以搞清楚它的一些基本概念很重要。血液/血浆/PBMC
先看看百科里面给的资料:
血液是流动在人的血管和心脏中的一种红色不透明的粘稠液体。
血液由血浆和血细胞组成,一升血浆中含有900—910克的水,65—85克的蛋白质和20克的低分子物质,低分子物质中有多种电解质和有机化合物,血细胞包括红细胞和白细胞和血小板三类细胞。
红细胞平均寿命为120天,白细胞寿命为9—13天,血小板寿命为8—9天。
一般情况下,每人每天都有40ml的血细胞衰老死亡。
同时,也有相应数量的细胞新生。血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分,有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。

下面是我随意找到一个示意图:

再看看血浆是什么:
血浆的主要作用是运载血细胞,运输维持人体生命活动所需的物质和体内产生的废物等。血浆相当于结缔组织的细胞间质。血浆是血液的重要组成部分,呈淡黄色液体(因含有胆红素)。血浆的化学成分中,水分占90~92%,其他10%以溶质血浆蛋白为主,并含有电解质、营养素(nutrients)、酶类(enzymes)、激素类(hormones)、胆固醇(cholesterol)和其他重要组成部分。血浆蛋白是多种蛋白质的总称,用盐析法可将其分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原三类。

最后再学习一些PBMC:
英文全称:peripheral blood mononuclear cell
外周血单个核细胞,指外周血中具有单个核的细胞。
包含淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。

关于它们有一系列的提取分离的实验操作方法。








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发表于 2017-2-26 19:04:53 | 显示全部楼层
一、PBMC的分离
1、取柠檬酸钠、EDTA或肝素抗凝血若干毫升,2000r/min(或500×g)离心5min后,用移液管取出上层血浆,分装冻存备用,然后向血细胞沉淀中加入相同体积(如血液为4ml,离心后取血浆1.5ml,剩余2.5ml,则加入无菌PBS 2.5ml)的Hanks液或无菌PBS(1×,PH7.2),也可用无血清培养基将细胞沉淀混匀。混匀时避免产生气泡。
2、用吸管将淋巴细胞分离液小心地加于离心管底部。尽量避免吸管触碰管壁,分离液柱高不超过离心管的1/4。
3、用吸管将用Hanks液或无菌PBS(1×,PH7.2)混匀的细胞沉淀沿管壁徐徐加于分离液上面,避免血液冲入分离液中(不能使液面破裂,这是关键的一步),而应使之重叠于分离液上。两者柱高之比为1:1,总柱高不超过离心管的2/3处。
4、将盛有分离液和血液的试管置水平离心机中,以2000r/min离心30min。使用软加、减速设置,软加速档3,软减速档设为1。温度设置为23℃
5、离心毕,取第2层(如图,即monocytes and lymphocytes)。尽量少吸取分离液。
6、加5倍以上体积Hanks液或无菌PBS(1×,PH7.2)于PBMC中,用吸管轻轻吹打均匀。避免产生气泡,液柱高度不超过离心管的2/3。以1200r/min(或300×g)离心10min,快速倾出上清液。
7、用Hanks液或无菌PBS(1×,PH7.2)重悬细胞,洗涤2次,每次都以1200r/min(或300×g)离心5min。其中最后一次洗涤时,要定量加入Hanks液或无菌PBS(1×,PH7.2),吹打均匀后取样计数细胞。取0.1ml细胞悬液加0.1ml白细胞稀释液,混匀后吸取1滴,加至计数盘内,使悬液充满计数盘,按白细胞计数法计数4个大方格内的细胞数,以下式计算细胞悬液的细胞密度:
细胞密度=4大格的细胞总数/4×104×稀释倍数(个/ml)
8、检查细胞活力。取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液,混匀。5min后,显微镜下检查。活细胞不着色,死亡细胞呈蓝色。共计数200个单个核细胞,求出活细胞的百分率即细胞的活力。
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