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【读文献】了解一些ctDNA检测的基础知识

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发表于 2016-9-14 14:54:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
前些天有朋友跟我讨论了ctDNA检测相关研究的问题,其实这个科研应用热点,我虽然有关注,但其中的细节并不甚了解,所以就抽空看一些文献,希望可以总结一些有用的知识点,从而回答她的问题。
cfDNA(cell free DNA)就是在血浆中发现的游离的DNA片段。
ctDNA即循环肿瘤DNA片段(ci rculating tumor DNA),是指cfDNA中来自肿瘤释放的DNA片段,所以本质是cfDNA的一种。(还有一种cfDNA更出名,就是胎儿的,用来做产前检测!)
所以肿瘤早筛大部分都是抽取受试者的血液开始,如果是检测ctDNA,就需要提取分离血浆中的DNA。而且,值得注意的是ctDNA只占cfDNA的非常小的比例,所以需要非常精确的实验检测手段。

关于一个新的技术,如果我们需要学习,我个人的经验是:
首先了解它的基本概念,然后它的优缺点是什么,它的应用方法如何,还有哪些改进的地方?

ctDNA/cfDNA的范围是?测量到的ctDNA的性质如何区分于cfDNA的背景噪音?
需要捕获基因组的哪些特定区域的片段?全基因组还是全外显子呢?或者是一些特定的gene panel?
NGS/PCR/hybrid这3种手段来检测ctDNA的区别是什么?
对于NGS,需要的测序深度是什么范围?技术限制是什么?
不同癌症或者不同个体差异很大吗?
既然是癌症早筛,那么最快可以在癌症的发生前后的哪个阶段发现呢?
样本制备有什么需要注意的吗?抽血或者其它?
需要测定ctDNA的哪种变异形式(SNV/CNV等),各有什么优缺点?

首先我google了关于 ctDNA mutation / sequencing error 这样的文献,找到了几个还算不错的paper,列表如下:
2014-An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage:http://www.nature.com/nm/journal/v20/n5/abs/nm.3519.html
2012-Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3426449/
2013-Ultradeep sequencing detects GNAQ and GNA11 mutations in cell-free DNA from plasma of patients with uveal melanoma: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cam4.61/full
2011-Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing:http://www.pnas.org/content/108/23/9530.full
2013-Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA: http://www.gastricbreastcancer.com/pdf/7.%20Murtaza_nature12065.pdf
2015-Circulating Tumor DNA Analysis for Liver Cancers and Its Usefulness as a Liquid Biopsy;http://dx.doi.org/10.1016/j.jcmgh.2015.06.009
2015-Cell-free circulating tumor DNA in plasma/serum of non-small cell lung cancer:http://link.springer.com/article/10.1007/s13277-014-2758-3
2015-Assessment of Circulating Copy Number Variant Detection for Cancer Screening:http://biorxiv.org/content/biorxiv/early/2016/02/29/041848.full.pdf
2015-Mutation profiling of tumor DNA from plasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with a novel, high-sensitivity multiplexed mutation detection platform:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4385870/
2016-Mutation analysis of cell-free DNA and single circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients with high CTC counts :http://www2.le.ac.uk/partnership/lcrc/copy_of_documents/shawclincanres2016
2013-meeting-Ultra-high quality sequencing assay for comprehensive genetic panel analysis of rare tumor-derived circulating cell-free DNA:http://www.ashg.org/2013meeting/abstracts/fulltext/f130121438.htm
2016-Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches:http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X16301041
2016-Cell-free DNA (cfDNA): clinical significance and utility in cancer shaped by emerging technologies :http://mcr.aacrjournals.org/content/molcanres/early/2016/07/15/1541-7786.MCR-16-0044.full.pdf

我会在下面持续跟帖来聊聊自己对这几篇paper的解读:


https://github.com/zhmz90/ctDNASomaticVariantCall.jl

会议:
http://www.biomarkerworldcongress.com/Cell-Free-Biomarkers/15/
http://cn.giievent.tw/chi335382/Circulating-DNA.shtml














上一篇:血液-血浆-PBMC
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 楼主| 发表于 2016-9-14 17:36:39 | 显示全部楼层
2016-Cell-free DNA (cfDNA): clinical significance and utility in cancer shaped by emerging technologies :http://mcr.aacrjournals.org/content/molcanres/early/2016/07/15/1541-7786.MCR-16-0044.full.pdf
这篇综述写的非常棒,而且是最新的!!!

Early discovery andapplications of cfDNA
早在1948年前,就由Mandel and Metais发现了cell free DNA (cfDNA),直到17年后,才由Bendich et al提出假设,肿瘤来源的cfDNA可能与肿瘤转移有关。但还是又经过了好几年才有直接证据表明cfDNA 与疾病相关。然后讲了一下cfDNA在产前检测的应用,以及器官移植。而且cfDNA在血浆中的含量也是很有应用的,可能与sepsis and septic shock; aseptic inflammation; myocardialinfarction; stroke有关,因为它的浓度预示着细胞凋亡的水平。
Properties of cfDNA
非常多的证据表明cfDNA是细胞凋亡的产物,是双螺旋结构而且高度片段化。大多数片段在150bo左右,可能是因为核小体结构特征,其余的片段也大多数150bp的倍数,有趣的是,关于cfDNA的结构完整性是否跟癌症有关还饱受争议。Madhavan et al等人认为cfDNA的结构完整性越差,预后越差,但Wang  et al早在2003就发现cfDNA的结构完整性越好,预后越差。但我们都知道,cfDNA的结构完整性越差说明细胞凋亡越夸张,而cfDNA的结构完整性越好,说明肿瘤细胞增殖越快,这就预示着,并不是只有凋亡的细胞才会释放cfDNA。但不管哪种情况,所有实验结果都可以说明,高达90%cfDNA的片段长度都是在150bo~181bo
cfDNA的含量在不同疾病状态的个体中差异很大,2008Fleischhacker等人研究的结果表明在癌症患者体内cfDNA的含量的低于100 ng/mL,跟我们的结果是一致的,我们测了62metastatic prostate cancer (mCRPC)病人,平均cfDNA的含量是53 ng/mL,假设人的一个细胞的二倍体基因组质量是6pg,那就是7.7万个二倍体的基因组。除了要看cfDNA的绝对含量,还得关心ctDNA/cfDNA比例,跨度也很大,0.01 to 1.7%,这个数据是通过捕获测序特定的基因区域来看看突变的reads与未突变的reads比例(假设未突变的reads来源于正常细胞的cfDNA,而突变的reads来源于突变了的癌症相关的cfDNA,也就是ctDNA),但有趣的是捕获片段是通过PCR方法获取的,如果降低了PCR区域1296 to 100 bp,得到的结果里面ctDNA的含量会提高5~20倍。有几个其它研究结果也有同样的发现。还有cfDNA的半衰期相关知识点。
Collection and processing ofblood for cfDNA
包括血液采取,提取DNA制备样品,等系列实验操作流程都必须标准化,才能保证结果的可比较性。血液处理过程中的细胞破损是最大的cfDNA污染源,一般来说,血液里面的血清serum会比血浆plasma含有更多的cfDNA,所以plasma会更适合被研究,但是血液收集和离心的过长也会大大的影响。为了解决这一问题,the British Columbia Cancer Agency and Vancouver Prostate Centre的研究者提出了用EDTA管收集保存血液,以1,600rpm的转速离心2小时,而不是肝素管,另外一个替代选择是cell-free DNA BCT tubes from Streck
Biological role of cfDNA
尽管cfDNA已经被发现了近70年,但以前只是被认为与免疫反应和血液凝固有关,
Genomic analysis of cfDNA
The presence of tumour derived DNA in cfDNAimplies the entire spectrum of tumor genome aberrations are present and canthus detected. However, the low amount, high degradation and high admixture of normalDNA in cfDNA pose major challenges for the development of sensitive and robust detectionpipelines.
Assessing specific DNAchanges
这个章节讲得是测基因组的哪些片段的问题

然后花了很大的篇幅,从下面3种检测手段来一一举例,并说明优缺点,非常详尽的描述,值得花时间好好看看!
Analyzing cfDNA using massively parallelsequencing
PCR-based methods for cfDNA sequencing
Ligation and hybridization-capture methods
所以下面的其它文献,都是基于这3个方向来利用ctDNA的。
Error suppression methods
Commercialization Efforts



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 楼主| 发表于 2016-9-14 17:36:50 | 显示全部楼层
接下来读的是 2012年的一篇技术文献:2012-Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3426449/


要想利用好ctDNA来作为biomarker,最重要的就是distinguish true mutations from sequencer misreads and PCRmisincorporations,而本文的作者提出了一个新方法,达到了 万分之二的 检测水准。而且利用modularbarcode tags可以做到同时检测多大百位的病人。作者在non-small cell lungcancer里面做了实验,证明了ctDNA的利用价值。
NGS技术发展之前,就有过非常多的尝试来利用ctDNA,但效果很有限,计算现在有了超深度测序,也受 errorrate of the sequencer的限制,因为ctDNA/cfDNA 一般在0.2%左右,根本无法与测序错误分开。

根据相应的法律法规,作者招募了30 patients with stageI-IV NSCLC病人,从他们身上取了117个样品。根据相应的实验操作手册提取了DNA Amplificationof mutation hotspot regions was carried out in triplicate for each sample usingtwo successive rounds of PCR, with primers designed to flank codons 12 and 13of KRAS, codon 858 of EGFR, and codon 600 of BRAF.做了两轮PCR,这个就是作者技术关键所在。详细技术细节请看:SupplementaryMaterials and Methods.  第一轮PCR,主要是把突变热点区域的片段给特异性的扩增富集出来,作为第二轮巢氏PCR的模板,而且被添加6bp的特异性barcode,都用得是高保真酶!
实验细节,我看的有点头疼,理论上看懂了这个实验流程图,就懂了这个文章,但我没有什么灵感

为了测试作者开发的新的方法,他们拿3个已知突变位点的细胞系混合正常细胞系,混合比例从10,000:1 1:10,000IlluminaTruSeq + HiSeq2000 +75 PE。

为了简化证明过程,作者只拿了codons 12 and 13 of KRAS, codon 600 of BRAF, and codon 858 of EGFR 这些片段做测试。 Weobtained a median depth of 108,467 readpairs per mutation site per sample after filtering and de-multiplexing atotal of 86,359,980 raw sequencesgenerated on a single lane of anIllumina HiSeq 2000 flow cell.
他们选取的PCR引物区间特别短,小于50bpBy discarding clones that did not have perfectsequence agreement between the two paired-end reads, we were able to eliminatethe vast majority of sequencer-generated errors. Imperfect sequence agreementwas found in 22% of read pairs that had already passed Illumina’s chastityfilter. 测序错误率从0.31%per base 降低到 0.07% per base.
部分由 polymerase misincorporations or DNA damage. 引入的测序错误,我们把测序样品一式三份来测序,根据三次测序结果的可重复性(假设真正的ctDNA上面的mutation是一致的,但是测序错误是多变的,随机的),因此把测序错误从0.014% 降低到0.0052% to 0.023%;
然后作者探究了不同的NSCLC病人亚型ctDNA变异检测的情况。
重点就是作者提到的他们的两个关于除去测序相关错误噪音的原理,其实我并没有看懂!



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 楼主| 发表于 2016-9-14 17:37:01 | 显示全部楼层
2013-Ultradeep sequencing detects GNAQ and GNA11 mutations in cell-free DNA from plasma of patients with uveal melanoma: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cam4.61/full
本文关注的是Uveal melanoma,还是要解决如何检测到低频突变的reads的难题,肿瘤发生发展过程中的oncogenes or tumor-suppressor genes 必然会有各种突变,而肿瘤细胞的破碎会释放出 带有突变的的ctDNA,但是正常细胞释放到血液里的未突变的cfDNA
已经发表的数据表明:Mutations of either GNAQ or GNA11 canbe detected in 83% of all (primary or metastatic) uveal melanomas。所以本文重点是通过超深度测序来探测 mutant-to-normal reads
Real-time polymerase chain reaction (PCR) 来定量cfDNA的浓度,通过universal tailed amplicon sequencing strategy技术来特异性的扩增GNAQ Q209 (298 bp), GNAQ R183(212 bp), GNA11 Q209(150 bp), and GNA11 R183(249 bp) regions 这几个片段。
但他并没有解决什么问题,还是提出了他的两个限制:
因为即使在正常人数据里面,我们也能检测到超过0.1%的‘突变’reads,所以我们保守的认为超过1%的突变reads才为真的,而且我们还要求是正负链均有突变的reads发现,而且测序过程中带来的错误,大部分取决于序列上下文和突变类型。
本文提到了可能的两个解决方案如下:
mutation-specific PCR method
target the PCR primers to smaller regions


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 楼主| 发表于 2016-9-14 17:37:20 | 显示全部楼层
2011-Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing:http://www.pnas.org/content/108/23/9530.full
尽管大规模平行测序技术是检测cfDNA里面的少量ctDNA的最佳选择,但是如何调和error ratesrare variants 之间的矛盾也是一个很大的挑战。所以本文作者提出了 Safe-Sequencing System (“Safe-SeqS”) 这个方法,特性有3
(i) assignmentof a unique identifier (UID) to eachtemplate molecule,
(ii) amplification ofeach uniquely tagged template molecule to create UID families, and
(iii) redundantsequencing of the amplification products.
PCR fragments withthe same UID are considered mutant (“supermutants”) only if ≥95% of themcontain the identical mutation.
其实很简单,就是通过实验技术手段给待测序的所有DNA模板都加上UID,这样模板的PCR产物理应与模板DNA序列一致,如果一致性超过95%,就认为该位点的突变可能是真实的。
UIDs,sometimes called barcodes or indexes

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 楼主| 发表于 2016-9-15 22:07:27 | 显示全部楼层
2014-An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage:http://www.nature.com/nm/journal/v20/n5/abs/nm.3519.html
这也是一个技术贴,cancer personalized profiling by deep sequencing (CAPP-Seq) ,但是我现在打不开文章正文,明天再看看
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