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miRNA芯片研究知多少?

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发表于 2017-8-12 11:54:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
伯豪生物在miRNA芯片领域,经过严格平行试验优选,先后建立起三大技术平台:Agilent miRNA芯片平台,Affymetrix miRNA芯片平台以及ABI miRNA定量芯片平台(定量原理),运用我们的平台已经进行了数万份样品的miRNA芯片检测服务。今天就跟大家分享一些我们多年miRNA芯片研究的经验,新一期的「你问我答」送给您~

1、Q:我看大家做microRNA芯片实验用的最多的是Agilent和Affymetrix这两个公司的芯片,具体到我的实验上我应该选哪个呢?

A:这个问题……真不好回答啊!

举个栗子:假设班级里有两个优等生,这次月考A排第一下次月考B排第一,两人势均力敌的时候就不能说谁一定比谁强了啊。具体到这两个品牌的芯片选择上也是如此。

但是同样,A和B两个学生都有各自擅长的科目,两个品牌的芯片也有自己独特的地方,或许这些信息可以帮助你来选择。

从上样量上来看,Agilent芯片需要total RNA低至100ng(纯化后)就够了,而Affymetrix芯片需要500ng,如果是从血液里分离血浆microRNA往往就选择做Agilent芯片的多,要是做Affymetrix那得抽一个人的多少血啊……

从物种覆盖来看,Aglent商品化芯片只有人、大鼠、小鼠三个物种的microRNA芯片,而Affymetrix最新版本的microRNA芯片上覆盖了203个物种的几乎所有microRNA,数据与miRBase 20.0版本同步,因此你可以看一下你要研究的物种适用于哪一款芯片。
如果都不适用那也没关系,Agilent提供了免费的定制设计芯片服务,你只要提供microRNA的信息,就可以为你私人定制一款你的物种专属的microRNA芯片哦!

此外还有很多因素帮助我们来选择,比如我们研究microRNA同时还想研究它的生成机制,观测一些前体microRNA(stem-loop)的表达,那么我们可以选择Affymetrix芯片,它上面有探针可以针对人、大鼠、小鼠的microRNA前体来检测,而Agilent可以把stem-loop与mature microRNA加以区分,却不能检测前体。

最后,Affymetrix还可以检测除了microRNA之外的一些其他小RNA如snoRNA、scaRNA哦!

2、Q:啊啊啊啊……我从文献里找到一条microRNA怎么在我的microRNA芯片上找不到了啊?

A:嗯……可能有两种原因:

①   这个文献是前几年的吧?你从文献里看到的microRNA的名称可能属于旧有命名体系的,比如名字后面那部分是”*”、”s/as”等,从miRBase 17.0版本开始这种命名方式就被更新了,新的命名统一为后面改为“-3p/5p”。

②   很不幸……当然这个不幸更多地是对该文献的作者而言,他报道的这条microRNA后来被证明是个冒牌货,比如是其他RNA的小片段或者早已经被归入其他microRNA名称之下只是一时没被注意到罢了,现在经过纠正,在miRBase数据库里删除了它的记录,这样最新版的microRNA芯片里自然也米有这条microRNA啦!

不管是以上哪种原因,你都可以到这个网站http://www.mirbasetracker.org/去查一下,它提供了所有microRNA在所有miRBase数据库内不同版本间的变化信息。

3、Q:我们医院科室近几年陆续收集了一些PAXgene管保存的全血样本,我可以用来做microRNA芯片么?

A:如果是加了EDTA类抗凝剂后放在-80°C冰箱保存的样本,那么只能做DNA实验了。

一般PAXgene管保存的全血样本是可以做microRNA芯片的,需要用专用的试剂盒来抽提它。这里的microRNA基本都是血液细胞里的microRNA啦,游离的microRNA相对来说含量低很多。

PAXgene管只能用来收集全血而不能分离血浆和血清,因为它是直接把血液内细胞裂解掉的。管内预装的RNA稳定剂能够阻断RNA的降解以及防止体外诱导产生新的RNA转录本。

4、Q:师兄告诉我说做microRNA芯片血浆的效果要比血清要好,真的吗?为什么呢?

A:从实际操作的角度考量,血浆的可控性比好。在分离时EDTA抗凝的离心力是很可控的,而分离血清时的血液凝过程固就很难说了,每个人的血的凝血因子都不一样, 还常常容易出现溶血等,所以血浆更为可靠。

血清样本不是不能做,但是从血清的数据可以观测到芯片结果的检出率普遍偏低,并且相对而言是有的高就很高,低的很低,其实这种数据是没有办法进行生物标志物筛选的。

如果一定要做血清样本的microRNA芯片,那么实验设计就很重要,特别是要设立好对照。往往具体操作中一份血清是不足够上样一张microRNA芯片的,这时有人就会采取多个样本混合上一张芯片,这么做本身倒是没有问题,但即使是混样,也要考虑是否合理。比如取样的时候,有1/3发生溶血,如果以每5个样本一混的话,基本上都是溶血的,那么就悲剧了。。。混样做实验,最好每个样本单独抽提,做芯片之前取等量的RNA混匀,这种做法会好一些。数据出来后,如果要回到每个样本做验证,还有单独的样本在。所以混合样本的实验不是我们科研人员想象那么简单的混匀,在设计和样本的质控方面要特别仔细。在芯片上省了钱,在样本的处理上就不能省钱。

5、Q:一般来说,各种不同类型的样本做microRNA芯片检出率如何呢?

A:一般来说检出率最高的是组织样本和细胞样本,全血样本的检出率也很高,低一些的就是血浆样本,血清样本和FFPE样本等。来自唾液、尿液、乳汁等样本的microRNA含量很低,检出率也是接近血清血浆样本的。

这只是一般情况下而言,特殊实验中也会有很多例外情况比如细胞类样本也会有检出率很低的情况出现。

6、Q:我这有30条microRNA,我要预测靶基因该怎么做?

A:一般思路是:micrroRNA预测靶基因,然后有些数据库是收录有文献报道的经过实验证实的miR-靶基因关系记录的,我们一并拿过来与预测得到的靶基因取一个并集,再对它进行基于GO或者KEGG的富集分析。有时候我们还会多多个靶基因预测工具的结果先取一个交集,但这里需要注意的是选取那些认可度高一些的、更新比较及时的靶基因预测工具,比如很多同学还在使用一个著名的在线靶基因预测工具PicTar,但是它的数据库已经十多年没有变化了,以人为例有2/3以上的microRNA没有被收录在内。

具体到你的问题上,我只能先说:你的mciroRNA实在是太多啦!

以人为例,有文献报道平均每个microRNA调控多达400个基因的表达,如果用预测工具等得到的数据会更多,30条microRNA得到的靶基因结果总集妥妥地破万哦!人的基因数量总共也就不到三万个,一下子用1/3-1/2的基因去做富集分析肯定是没有什么意义的。

所以,先把你要研究的microRNA数量先控制在一个有限的范围内吧,15条以内最好。

7、Q:继续前面的话题,这么多microRNA啊,30多条我哪条都舍不得丢掉,我该怎么取舍啊?

A:emmm……给你几个建议,你可以综合考虑全部选用或者只用某几条建议:

①   选择表达变化倍数大的以及信号值高的microRNA,比如两组间比较变化倍数至少在2倍或更高,越高越好。同时标准化表格里microRNA信号值不小于5。

②   选择microRNA名称里数字编号比较小的,比如miR-6088就不如miR-21,前者被研究得较少,可使用的先验信息不多,而miR-21简直就是个超级明星一般的存在,研究它的文献很多很多都是可以供我们借鉴的。当然,你认为开垦处女地更有意思,那就选择被研究得少的那个也可以啊,加油!

③   虽然很少出现一个microRNA就行使功能会调控信号通路的存在,但不妨碍我们把每个microRNA单独拿出来观察其靶基因富集情况,选择与我们研究目的最为接近的结果对应的microRNA,伯豪有超级超级好用的在线富集分析系统供你使用哦,鼠标在手,天下我有!

8、Q:我是临床医学的新生,想知道哪些样本可以做microRNA芯片检测呢?

A:microRNA是个调皮的小家伙,它仗着自己身轻体快无处不在。比如唾液、乳汁、尿液、脑脊液、胆汁等种种体液中,这也是为什么很多人选择microRNA作为生物标志物研究的一个重要原因,取样方便啊!

还有那个被很多人叫做外泌体的英文名为exosome或exosomes的小囊泡能在体内运送很多东西从一个地方到另一个地方,microRNA自然也是它的乘客之一,特别的是它不仅是一个运输工具,同时还是一个加工厂,能从A地方装载microRNA的原料前体,路上边走边加工,到了目的地时已经把microRNA加工为成熟体来行使功能呢,真的很神奇。

9、Q:从芯片结果里筛选得到了我心仪的microRNA,后面我该怎么做?

A:首先我们要知道,芯片是一个高通量筛选的工具,它的结果本身还需要再次验证,所以我们要先用qPCR等方法验证这条你心仪的microRNA是否真的是一个有着足够差异表达量的microRNA。

当这一结果确认以后,才可以进行后续的研究譬如功能研究机制研究等,看靶基因表达水平变化也可以做qPCR或者Western Blot。但是首先要做microRNA与靶基因的调控关系的确认实验,常用的是荧光报告酶Luciferaseassay实验。

10、Q:啊啊啊我的microRNA芯片结果里有一个样本和其他的差异好大我该怎么办?

A:同学莫慌!待我们来一起讨论下。一般来说芯片结果都是经过严格质控的,数据不会发生很大的系统性偏差。这时我们要看看是不是样本编号之类的发生了混淆,或者你这是一批临床来源的样本,某个供体有很严重的其他并发症等导致microRNA表达谱与其他的小伙伴们不一致?



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你这个问题很复杂,需要打赏,请点击 http://www.bio-info-trainee.com/donate 进行打赏,谢谢
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 楼主| 发表于 2017-8-12 11:54:58 | 显示全部楼层

伯豪生物 在芯片服务提供这一块很专业,大家可以联系他们
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