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通过EZH2和BMI1抑制治疗胶质瘤

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发表于 2017-11-14 10:33:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
Plus深读 | 通过EZH2和BMI1抑制治疗胶质瘤
原创 2017-11-11 宁宁 23Plus



编者按
成年人大脑中,胶质瘤(Glioma),是发病率最高的原发性恶性脑部肿瘤,细胞增殖快、侵润性强,经典的手术切除困难,且复发率高,术后生存期短(中位生存期为1年左右)。胶质瘤主要发病集中在中老年人,即55-60周岁以后人群,侵袭性强,治疗难度大,预后差,复发率高。

胶质瘤发病机制复杂多样,在基因组水平上不存在特异有效的共同作用靶点。TCGA(癌症和肿瘤基因图谱)分析证明,胶质瘤的发病与多个基础的原癌和抑癌基因及其通路的异常相关,比如P53、P16、PTEN等功能的缺失、和EGFR、BCL-2、PI3K功能的过剩。因此,胶质瘤的诊断手段主要是常规头部CT和MRI等,缺乏可用的特异性分子靶标、探针和试剂盒等。相应的,目前为止针对于胶质瘤的药物治疗手段,也集中于针对多种肿瘤都适用的广谱性药物。同时由于神经胶质瘤的发病位置-大脑,存在“血脑屏障”,即使肿瘤后期破坏血脑屏障,也会造成疾病治疗的延误等。

本研究论文发现了胶质瘤与表观遗传修饰之间的密切联系,并尝试利用表观遗传因子(EZH2和BMI1)等抑制剂,在小鼠原位胶质瘤模型中开展治疗,为胶质瘤的药物治疗提供了新的靶向位点。

实验结果
研究证明,神经胶质瘤的实体瘤中,可能存在多种细胞来源,并且不同来源的细胞可能位于不同的肿瘤位置,如Figure 1A:
1)ER,enhancing region,表达原神经基因标记(proneural gene),有血管形成,故可能会破坏血脑屏障,其中的胶质细胞瘤干细胞称为proneural GSCs(glioma stem cells)

2)NR,necrotic region,坏死区域,有氧化压力,表达间质细胞标记(Mesenchymal gene),其中的胶质细胞瘤干细胞称为Mesenchymal GSCs

3)EM,enhanced margin
通过检验不同标记基因的RNA水平(Fig.1B)和荧光蛋白定量(Fig.1C),再次验证ER区主要表达SOX2和OLIG2为代表的proneural GSC markers,NR区则主要表达Mesenchymal GSC markers CD44和YKL40。VEGFR2、CD31等血管生成相关蛋白主要在ER中表达,而氧化胁迫相关的GLUT、HIF1A等主要在NR中表达(Fig.1D);相应的,血管von Willebrand factor染色的同样在ER中,氧化反应的carbonic anhydrase 9染色则出现在NR(Fig.1E)。


Figure 1. 胶质瘤分区以及相应蛋白标记

接下来研究者开始将胶质瘤不同分区(ER和NR)与表观遗传修饰联系起来。Polycomb蛋白以及功能在整个生物界都非常保守,它主要包含两个复合体,即PRC1和PRC2,都参与到表观遗传调控中。其中PRC2能够催化H3K27的三甲基化形成H3K27me3,被修饰后的组蛋白又会进一步被PRC1复合体催化产生H2AK119Ub。除此之外,PRC1也被证明能够催化其他非组蛋白修饰依赖的转录抑制,以及染色体构象的变化。

首先由于CD15在各种类型GSCs中表达广泛,故选择CD15作为通用marker。免疫荧光证实ER处的proneural GSCs中主要是H3K27me3的修饰,相应的NR处Mesenchymal GSCs中主要是H2AK119Ub修饰(Fig.2a)。H3K27me3和H2AK119Ub的ChIP-seq结果分析发现,这两类结合的绝大部分片段都是不同的(Fig.2B-C)。具体表现在:PRC2主要在ER中起作用,调控H3K27me3水平,控制基因转录(Fig.2D),PRC1主要在NR中起作用,通过调节H2A119Ub水平。控制与炎症、胁迫等相关的transforming growth factor-β (TGF-β)、nuclear factor-κB (NF-κB)和WNT等信号通路(Fig.2D)。PRC2成员EZH2在ER区的proneural zone中有较高表达了(Fig.2E),而PRC1则在NR区的Mesenchymal zone中活性相对最高(Fig.2F)。


Figure 2. 胶质瘤中不同表观遗传修饰的分布和功能探索

有趣的是,进一步分析这些样品中EZH2和BMI1阳性与生存期之间的联系,发现双阴性的病人的生存周期最长,两个蛋白都有表达的病人生存最短,而仅有任何一个表达的则位于二者之间,这证明了表观基因组水平、与胶质瘤恶性程度、病人预后之间的密切关系(Fig.3B)。研究者利用胶质瘤病人样本切片,IHC验证这些表观遗传因子与不同区域(ER和NR)、不同细胞来源的GSC(Proneural和Mesenchymal)等的共定位情况。结果发现,EZH2(催化H3K27me3)与Proneural marker OLIG2同样定位在原神经细胞区域GSC,相应的BMI1(催化H2AK119ub)与MSC marker CD44共同定位在间质细胞来源GSC中(Fig.3A)。

同样的,WB结果发现:BMI1、H2AK119Ub、CD44、YKL40蛋白在Mesenchymal GSC中水平高,在Proneural GSCs中水平低;而EZH2、H3K27me3、OLIG2和SOX2则刚好相反(Fig.3C)。为了解释BMI1等蛋白在Proneural GSCs中的水平,研究者分析了BMI1在两种GSC中的泛素化水平:

PN1919:Proneural GSCs,lactacystin(乳胞素,抑制蛋白酶体活性)处理可见大量泛素化条带,并且BMI1蛋白量会相应上升,证明生理状态下BMI1会通过泛素化蛋白酶体途径降解。而这一过程在MES28(Mesenchymal GSCs)中不会发生。

接下来研究者利用TCGA胶质瘤数据库寻找可能会调控BMI1泛素化的E3泛素连接酶。通过表达模式、r value分析,找到RNF144A与BMI1负相关,即可能能够促进其降解。

实验证明,SOX2能够直接结合Rnf144A的启动子调控转录;RNF144A与BMI1有蛋白水平的直接结合;Rnf144A敲低影响BMI1的泛素化水平(Fig.3f)。

在低氧等胁迫处理下,也是Proneural GSCs中BMI1的表达会受到抑制,而Mesenchymal GSCs中则不会受影响(Fig.3g)。细胞学实验也证明,Mesenchymal GSCs的部分细胞能够抵御一定的胁迫条件(Fig.3h)。


Figure 3. 不同胶质瘤中EZH2和BMI1的功能及分区

敲低EZH2和BMI1都会抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤形成(Fig.4a-b)。区别在于,EZH2的敲低主要抑制Proneural GSCs,而BMI1的敲低主要抑制Mesenchymal GSCs的细胞增殖和肿瘤形成(Fig.4a-b)。同样的,分别利用两种蛋白的抑制剂也获得了类似效果,即PTC596(BMI1-i)和EPZ6438(EZH2-i)处理都会引起相应GSCs细胞增殖变化,再次证明了EZH2和BMI1的抑制功能(Fig.4c-d)。此外,将BMI-i和EZH2-i混合联用,肿瘤细胞杀伤的效果也会进一步增强(Fig.4e)。


Figure 4. 细胞水平分析EZH2和BMI1抑制剂在抑制胶质细胞瘤中的功能

由于PTC596(BMI1-i)和EPZ6438(EZH2-i)都能够进入大脑,因此进行了体内的药物抗肿瘤模型验证。

向小鼠大脑注射两种肿瘤细胞MES20-GFP(Mesenchymal GSCs)和PN1919-tdTomato(Proneural GSCs),成瘤后再分别注射药物(Fig.5A):
1)PTC596(BMI1-i)
2)EPZ6438(EZH2-i)
3)PTC596(BMI1-i)和EPZ6438(EZH2-i)

观察肿瘤发展和小鼠生存状况,发现PTC596(BMI1-i)和EPZ6438(EZH2-i)处理都能够抑制肿瘤发展、提高小鼠生存期;两种抑制剂同时注射则会进一步增强这一治疗结果(Fig.5B-F)。


Figure 5. 构建原位胶质细胞瘤小鼠,并分析EZH2和BMI1抑制剂的抑瘤作用

图片来源

1. Jin X, et al. Targeting glioma stem cells through combined BMI1 and EZH2 inhibition. Nat Med. Nov, 23, 1352-1361 (2017).

Reference
1. Wen, P.Y. & Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N. Engl. J. Med. 359, 492–507 (2008).
2. Singh, S.K. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396–401 (2004).
3. Galli, R. et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011–7021 (2004).
4. Jin, X. et al. Blockade of EGFR signaling promotes glioma stem-like cell invasiveness by abolishing ID3-mediated inhibition of p27KIP1 and MMP3 expression. Cancer Lett. 328, 235–242 (2013).
5. Patel, A.P. et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science 344, 1396–1401 (2014).
6. Tavares, L. et al. RYBP–PRC1 complexes mediate H2A ubiquitylation at Polycomb target sites independently of PRC2 and H3K27me3. Cell 148, 664–678 (2012).



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