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NanoString这种高通量的RNA表达检测方法

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发表于 2017-11-19 18:53:48 | 显示全部楼层 |阅读模式
NanoString是一种高通量的RNA表达检测方法。其优点是可以适用于严重降解的RNA样本,如:FFPE样本。且操作简单,数据准确、重现性好。本视频介绍了这种方法的原理,和部分的应用。

NanoString这个方法,目前主要应用在RNA表达量的分析方面。

我们先来说它的几个直接的优点。

首先,不必抽提RNA,直接可以用FFPE样本的裂解液,或者细胞的裂解液来做实验。

第2,它实验操作部分,非常方便一批12个样本,手工操作部分大概只有十几分钟。其余的步骤,都可以由机器来完成。

第3,是它对样本的数量和质量的要求都很低。石蜡样本当中的RNA,往往是严重降解的,许多分子生物学实验都很难处理(来自石蜡样本的RNA)。但是NanoString,可以很好地分析石蜡样本当中的RNA。

NanoString的仪器,分成一大、一小这样两台仪器。这台大的仪器,是做化学反应的(nCounterPrep Station)。小的这台仪器是做光学扫描读数用的(nCounter DigitalAnalyzer)。

那么,我们来说一下,NanoString的化学原理。

首先,是设计探针

1. 探针是一对、一对的。每一对探针,都针对一个特定目标基因的mRNA。

2. 每对探针分成:Capture探针(捕获探针)、和Report探针(报告探针)。其中capture探针的作用是把目标mRNA给抓住,并固定到玻璃板上。Report探针,它一方面与目标mRNA相结合。另一方面,它带了一串6个彩色的小珠子,通过小珠子的颜色和排列,光学识别软件可以在后期识别过程当中,把不同的report探针给识别出来,并加以区分、和统计。

3. Capture探针和Report探针,都分别有50个碱基,与目标基因的mRNA相互补。其中,Capture探针是对应于目标mRNA的5'端。而Report探针是对应于目标mRNA的3’端。Capture探针上,带了一个生物素。这个生物素,将与Cartrige的玻璃表面上所包被的链霉亲合素相结合。这个Cartrige也就是反应芯片。

4. 目前(新版)的Report探针上有6个彩色的小珠子,老版的Report探针上会有7个彩色的小珠子。每个小珠子有:红、黄、蓝、绿,4种颜色可选。每个珠子的直径是200纳米。通过珠子色彩的排列、组合,可以得到足够多种多样的变化。但是,相邻的两个珠子是不能同一种颜色的。这样设计,是为了便于后期软件对珠子的颜色进行识别。

5. 每次实验,最多可以测800种探针。也就是说一次最多可以测800种基因的mRNA。

实验的过程:

1. 是把含有mRNA的样本裂解液与探针进行孵育杂交。让Capture探针和Report探针与目标mRNA相结合。

2. 接下来,通过一系列的杂交、洗脱过程,把游离的、没有结合到目标mRNA上的探针,都给洗掉。

3. 留下来的杂交混合物,加到Cartrige上。

4. Cartrige的玻璃表面,是结合了链霉亲合素的。杂交混合液,加到cartrige上之后,进行摇动孵育。这样,Capture探针就被锚定在玻璃表面。同时,也把目标RNA连同结合在一起的Report探针,一同锚定在玻璃表面。

5. 再接下来,把Cartrige放到光学扫描仪上。在Cartrige上通上电场。因为Report探针上的彩色珠子都是带电荷的,这些珠子就在电场的作用下倒向一边,并且被拉直。

6. 然后,光学扫描仪就会对着玻璃板进行扫描。

7. 一个Cartrige上有12个通道,也就是一次实验可以做12个样本。

每个cartrige的价格在大约900美金。

NanoString公司提供探针的设计、和合成服务。每(一个)反应、每(一对)探针的价格,大概在0.5到3个美元之间。具体的价格会因为采购的探针数量、和反应数的不同,有所变化。

NanoString的方法有一系列的优点,我们在视频的开头,介绍了一些。接下来,我们做一个小结:

1. 就是它可以用少量的RNA来做实验。一般情况下,100ng的RNA,就可以做出很好的实验结果。

2. 第2个优点,是实验过程中,不必抽提RNA,可以直接用FFPE样本的裂解液、或者细胞的裂解液来做实验。而且,也不需要有反转录过程、和PCR过程。

3. 它可以测严重降解的RNA样本。例如:它可以测从石蜡样本(FFPE)中裂解出来的RNA。

4. 它的检测的动态范围非常大,它可以达到7*10^5。并且,实验数据的重现性、准确性,也非常高

5. 它一次可以测800种不同的基因的mRNA的表达量。所以,它是一个高通量的方法。

6. 它的实验过程当中,手工操作步骤非常少。全程要手动操作的步骤大约只有十几分钟。如果一批做12个样本,前面的化学反应三小时可以完成。后面的Cartrige扫描,6个小时,可以完成。也就是说一天可以完成一整个实验流程

2013年9月,美国FDA批准NanoString公司的Prosigna方法。Prosigna是针对乳腺癌进行分型,和预后评估的一种方法。这个方法,分析PAM50基因的表达量,PAM50是Prediction Analysis of Microarray 50(的缩写)。它是医学界公认的,可以对乳腺癌进行分型,并且进行预后评估的标准。目前,Prosigna方法,已经在北美和欧洲有较多的应用。

NanoString的Report探针是比较昂贵的。为了方便客户更灵活地设计实验,也为了让客户更高效地利用探针,NanoString公司开发了Element方法。

Element方法的原理,就是把Report探针拆成2段。一段是和目标mRNA序列相结合,另外一段,是连到彩色的小珠子。同时,也把Capture探针分成2段,一段是连到生物素的,还有一段,是和目标mRNA相结合的。这样设计的效果,就是只要换中间普通探针的序列,就可以探测不同的目标mRNA了。而普通探针的价格,是远低于Report探针的。

这样也就极大地提高了实验的灵活性,并且,也降低了实验人员开发新方法的试错成本。

NanoString公司还开发了检测microRNA的方法。

检测microRNA方法的原理是用桥接的方法,利用一段设计好的,互补的RNA链,把目标microRNA链和另外一个设计好的标签RNA链,杂交在一起。再用RNA链接酶,把这两段RNA连成一根RNA链。连完之后,把多余的桥接RNA、标签RNA都去掉。再用NanoString的方法,来做microRNA的定量检测。




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