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shRNA跟siRNA的区别

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发表于 2016-10-26 20:33:15 | 显示全部楼层 |阅读模式
siRNA和shRNA:通过基因沉默抑制蛋白表达的工具

Erin P O’Keefe (erinisok at gmail dot com)
Princeton University, United States

译者
潘海建 (ouchappy at sjtu dot edu dot cn)
上海, 中国。


DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.197

日期
更新 : 2015-03-08; 原始版 : 2013-06-05

引用
实验材料和方法 2013;3:197

英文摘要
A comprehensive review of siRNAs and shRNAs as tools for gene silencing.



RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解,或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性(下面讨论),通过短反义核酸(siRNA和shRNA序列)锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集,导致其水平的下降,最终实现抑制作用。
[放大]
图 1. siRNA和shRNA结构。(A) siRNAs是短的RNA双链,在3‘端有两个碱基的游离。 (B) shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。(C) shRNA 构建用于插入表达载体。源自 [1, 2] 。

背景

调控途径的发现和组成元件
早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年,Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而,直到1998年,Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果,他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
术语
描述
siRNA小干扰(siRNA),有在3’端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
shRNA短发夹RNA (shRNA) ,包含一个环结构,可加工成siRNA,也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.
Drosha是一种核糖核酸酶III的酶,可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。
Dicer核糖核酸酶III酶,能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25 bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA,而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用
RISC最小RNA诱导沉默复合物(RISC) 包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。
TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要
PACT蛋白R(PKR)-激活蛋白(PACT)。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.
Argonaute family of proteins和单链的RNA(siRNA)共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA,包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA,然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链(引导链)RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。

表一:RNAi机制的主要组成元件。

siRNA vs. shRNA作用机制
两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA(siRNA)和基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA和shRNA(图1)都可用于蛋白沉默,但它们的作用机制有所不同(图2)。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中(参见转运机制获取更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的,但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物,双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合,RISC由Argonaute-2 (Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开,其中一条链从复合物上分离。5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来,稳定的并入沉默复合物中。

图 2. RNAi介导的基因沉默机制。 在细胞核表达后,shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上,它们与siRNA的加工方式(以短的双链形态导入细胞,然后被Dicer识别)相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致其降解。源自 [3] 。

shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成,形成发夹结构,茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起(图1b和1c)。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制,shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体,shRNA被导入靶细胞的细胞核内,在某些情况下,载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同,shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前,这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切,去除发卡结构,产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。
一旦被整合到RISC后,shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分,siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA,从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点,siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物,而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA,然后由Dicer酶加工,形成正反馈循环,增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。
人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而,Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出,RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型,在该模型中,RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触,5'末端碱基配对比3'末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染,克服了某些类型的细胞不能转染的难题,能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达,能够与报告基因共表达。此外,它们能减少脱靶效应(在下面进一步讨论)。
一般方案

设计siRNA和shRNA
许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是,每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外,长双链RNA会激活先天免疫反应,导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素,包括环结构,发夹结构热力学性质,二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时,要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的,而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。
siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得
  • 19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。
  • 识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3'端19个核苷酸的位点。通常情况下,siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。较新的数据表明,其他种类的二核苷酸也可保持活性,但siRNA能够被核糖核酸酶在单链的G残基处裂解,因此应避免GG结构。
  • 由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的,应该要在不同位点选择至少2-4个靶序列。避免设计含有4-6个poly(T)的序列,因为它会作为RNA合成酶III的终止信号。
  • 检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性。
  • 序列中的G/C含量应该在35-55%之间。
公司/组织
程序名称
描述
链接
Thermo ScientificsiDESIGN方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域(5’或3’ UTR或ORF区),G/C百分比,可通过BLAST搜索序列。[size=0.75em]链接
Naito et al.siDirect根据核苷酸序列识别目标,提供了序列内的位置,可供选择双链的熔解温度,脱靶序列的不匹配的最小数目。[size=0.75em]链接
InvitrogenBLOCK-IT RNAi Designer在核算序列内识别siRNA, shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。[size=0.75em]链接
InvivoGensiRNA Wizard可搜索一段编码序列作为siRNA序列,可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。[size=0.75em]链接
IDTshRNA设计工具shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列,也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。[size=0.75em]链接
Gene LinkshRNA设计工具shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列,也可以指定5’端和3‘端的酶切位点,设计GC含量和长度。[size=0.75em]链接

表二:siRNA和shRNA设计程序。

shRNA应包含正义和反义序列(每个为19-21个核苷酸的长度)由环结构分隔,以及5'端AAAA的游离片段。设计环结构时,Ambion的科学家和其他人建议使用9 nt的空白间隔(TTCAAGAGA),而Invivogen在某些载体中采用了长度为7 nt的环(TCAAGAG),这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外,当创建shRNA盒时,正义链首先合成,然后是间隔序列,最后是反义链。 shRNA结构中5'端游离应避免,因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA,也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外,多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列(代表性例子见表三)。
多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶III U6启动子驱动,它驱动高水平的组成型表达,或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比,shRNA的一个主要优点是,shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统,以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用,它不像病毒载体递送分子,可以通过如上所述的siRNA分子一样,能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。
公司/机构
程序名称
他们能提供什么
Link
The Broad Institute (可通过Sigma-Aldrich和Thermo-Fisher Scientific进入)RNAi联营(TRC)通过公共-私人的努力,目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具[size=0.75em]链接
链接到RNAi联营shRNA文库: [size=0.75em]链接
Sigma-Aldrich功能基因组&RNAi(与TRC协同)提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRC shRNA[size=0.75em]链接
Thermo-Fisher ScientificSMARTchoice, GIPZ, TRIPZ Inducible, 和TRC慢病毒shRNA选项提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRC shRNA。[size=0.75em]链接

表三:提供预制的siRNA和shRNA的公司。

对照
为确保RNA干扰(RNAi)处理后观察到的效应是基因沉默的结果,而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA,或由于RNA干扰途径激活造成的,很重要的一点在于设置相应的对照组(表三)。两种最常见的对照是加扰对照(Scrambled Control)和非识别对照(Non-targeting Control)。加扰对照正像它听起来的那样,包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照,在另一方面,也是一个siRNA/shRNA序列,它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制,使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而,应该指出的是,即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径,但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此,在设计加扰对照序列的时候要特别小心,以确保遵循上述原则,且不会锚定其他的mRNA序列。
对于shRNA,另一个重要的对照包括空载体对照,它不包含任何shRNA插入,却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后,未经处理的细胞(无转染或转导)可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。
公司/机构
描述
Sigma-AldrichshRNA非识别对照
空载体对照
Thermo ScientificshRNA阳性对照(识别eGFP)
空载体对照
Invitrogen加扰siRNA对照
肌动蛋白, GAPDH, 或GFP阳性对照

表四:RNAi对照。

转运
确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型,因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同,包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默,以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的,而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。
质粒DNA或双链RNA的转染或电转
转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成,使它们能够穿过细胞膜。 质粒编码的siRNA,有时也有shRNA,通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。
  • 脂质转染。具有长疏水链头部带正电荷基团的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA相互作用,在脂双分子层环绕siRNA,随后被细胞内吞。
  • 基于阳离子聚合物的纳米粒子。
  • 这可降低毒性,提高效率,并且能够转运修饰的siRNA。
  • 脂质或细胞穿透肽(CPP)结合。这涉及到siRNA与疏水性基团(如胆固醇)或阳离子CCP(如转运蛋白或pentatratin)的结合,能够促进向靶细胞的转运。
在电穿孔实验中,电场施加到由磷脂分子和带负电荷的头部基团组成的细胞膜上。电脉冲引起磷脂的重新调整,在细胞膜上制造出孔道,允许siRNA的进入。电穿孔法常用于难以被转染的细胞。然而,针对每种细胞类型需要优化特定的设置(电压,脉冲数和脉冲长度)。
利用病毒载体转导
  • 慢病毒/逆转录病毒
    有许多慢病毒和逆转录病毒质粒适合shRNA的表达(请参阅下面的产品部分)。虽然根据不同实验(如靶细胞类型实验等)具体的质粒和shRNA设计可能会略有变化,基本的shRNA表达结构包含聚合酶III启动子、紧跟的shRNA(有义链、环状结构和反义链以及随后的五个T碱基)、相关的增强子元件、5'和3'端的LTR区以及一个包装序列。这一慢病毒或逆转录病毒质粒与包装质粒一起共转染到包装细胞系(如293T)中,包装质粒编码慢病毒生产所需的催化和包装蛋白。复制缺陷的慢病毒可用于转导靶细胞。慢病毒和逆转录病毒核酸转运的详细实验方案,请参阅 核酸转运:慢病毒和逆转录病毒载体
  • 腺病毒载体
    腺病毒是小的双链DNA病毒能够感染大多数类型的细胞。重组腺病毒有几个复制删除必需基因,能实现仅在互补包装细胞(293细胞)的复制和传播。 通过腺病毒衍生载体转运的DNA能够在细胞核内保持外染色体的状态,使其表达是瞬时表达,却可以消除插入突变的风险。腺病毒载体具有极为广泛的细胞趋性,在实验室中可以安全操作。虽然在组织培养实验中这是优势,但这些载体在临床上会出现问题。
  • 腺相关病毒(AAV)
    腺相关病毒(AAV)是一种小的单链DNA(ssDNA)病毒,在没有共感染辅助病毒帮助的情况下不能复制,如单纯疱疹病毒或腺病毒。腺相关病毒感染许多类型的细胞,通过进入细胞核,经历溶菌(在辅助病毒的存在下)或溶原性(在缺少辅助病毒的情况下)的生命周期。在没有辅助病毒的感染过程中,腺相关病毒整合到宿主细胞染色体中,导致潜伏性感染。在辅助病毒帮助下感染后,腺相关病毒生命周期被激活,复制出新的病毒。 AAV2是用于制造重组腺相关病毒载体的典型血清型。
    为防止重组腺相关病毒颗粒导致裂解复制,腺相关病毒的生产方式与慢病毒和逆转录病毒载体相似:用编码需要的转基因或shRNA的最小rAAV基因组的质粒感染生产新报,另一个质粒则表达腺相关病毒感染性病毒颗粒生产必需基因,以及第三个质粒编码腺病毒的辅助基因。 AAV载体提供长时间的稳定表达。它被认为在靶细胞内以圆形或线性串联形态保持稳定。使用这些病毒的一个主要缺点是基因转移要求比较高的感染多样性,而且高效价的重组AAV难以产生。此外,尽管作为病毒载体很有应用前景,但我们对AAV生命周期的理解还有很大差距。

方法
基因转运效率
分裂细胞
不分裂细胞
整合
细胞质还是细胞核
安全性和实验注意事项
转染取决于细胞类型、健康情况和克隆率,以及DNA的质量低效的RNA-细胞质 质粒-细胞核可复制的。在原代细胞、不分裂细胞以及体内效率比较低。
电穿孔高效(虽然这也取决于细胞类型)细胞核和细胞质对于转染困难的细胞比较好用。细胞死亡率很高,需要大量的优化。
重组腺病毒100%细胞质感染大多数类型的细胞。复制缺陷。能够处理大的插入片段(8 kb)。工作量大。
慢病毒<30%细胞核整合导致突变的可能最小。能够感染许多类型的细胞。改造的能够感染人的细胞,因此需要小心对待。
逆转录病毒<30%细胞核整合可能会导致突变,改造的能够感染人的细胞,因此需要小心对待。
腺相关病毒细胞核不致病。需要高效价。

表五:转运方法总结。

需要考虑的事项及问题解决

靶细胞、测定长度和靶蛋白
RNAi技术的一个限制是它可能并不适用于所有类型的细胞。例如,双链RNA特异性的RNA酶存在下使它们只是在线虫神经细胞中的效率非常低。另外,siRNA或shRNA的转运某些类型的细胞中不可能实现。有些细胞不能抵抗转染,它们不能接受病毒载体介导的转运。
选择siRNA还是shRNA介导基因沉默的一个重要因素是这两种方法的检测长度和目标蛋白的半衰期时间。虽然没有大规模的研究比较由siRNA和shRNA实现的蛋白沉默的持续时间和水平,但使用转染siRNA和质粒表达的shRNA的初步研究表明,shRNA针对这些标准更优。对于较长时间的检测,或试图沉默长半衰期的蛋白质,如P300(根据细胞类型和培养条件不同半衰期为10-22小时),可能需要shRNA的稳定表达。
要确定沉默的程度和动力学,必须要对蛋白质水平进行评估。确定沉默成功的最直接方法是进行免疫印迹实验。简单地说,这涉及到收集处理后的细胞(RNAi表达的和各种对照的)、溶解这些细胞、定量蛋白质,以及在变性SDS-PAGE凝胶上跑样品几个步骤。用特定的抗体检测后,可将RNAi处理细胞的蛋白质水平与对照组比较,从而确定沉默效率。详细说明 蛋白质定量 可以在来邦网上查找到。
如果沉默不足或没有观察到沉默现象,可以通过测量RNA水平来确保实现了靶mRNA的有效沉默。简单地说,收集对照和沉默细胞,获得RNA,反转录,用内控(如GAPDH)做量化或标准化。如果RNA水平下降,则需要较长的一段时间来实现蛋白水平的降低,特别是如果该蛋白丰度高或具有长的半衰期的情况下。在某些情况下,如果观察到蛋白不完整沉默并且mRNA水平没有完全降低,合并的siRNA(多个siRNA序列针对靶mRNA的不同片段)可以被引入到细胞中。关于 PCR的细节描述可以在来邦网上查找到.
脱靶的影响
虽然RNAi也许是最精确的基因沉默机制,但它仍然有特异性和非特异性的脱靶效应。后者可能是由于正义或反义siRNA链与非靶mRNA部分序列互补造成的。这在siRNA和shRNA中都是一个问题,且与转运方式无关。最少7个核苷酸互补就能够造成脱靶抑制,且与紧邻互补区域的序列组成,序列在mRNA的位置,以及mRNA中的序列拷贝数有关。
由于这些特定的脱靶效应,通过一些实验如基于微阵列的基因表达分析来测试它们就显得尤为重要了。可以对siRNA进行化学修饰减少脱靶效应(评论)。例如,在siRNA的第二个碱基2'位的核糖环添加甲基基团可以降低脱靶效应。然而,这些类型的化学修饰仅可能在siRNA低聚物中实现。有趣的是,有证据表明,shRNA的脱靶效应比siRNA的少。虽然目前尚不清楚为什么会这样,人们认为这可能是由于shRNA是在细胞核中转录的,对进一步处理更敏感。此外,siRNAs可能在细胞质中降解,导致脱靶效应。
非特异性的脱靶影响涉及干扰素激活和其他对双链RNA的免疫反应,以及核苷酸构建导致的细胞毒性,以及转运方式造成的影响。长的双链RNA会诱导强烈的天然免疫反应,这一作用于病毒感染过程中所观察到的类似,会导致mRNA全局性降解。 siRNA和shRNA在另一方面,只诱发的局部干扰素应答。由于其中一些激活作用是序列依赖性的,序列修饰可以减少shRNA或siRNA的免疫原性。与其特定的脱靶效应一样,siRNA低聚物的化学修饰可以降低诱导免疫反应的能力。然而,这些修改也会降低其基因沉默的能力。
体内和医学上的应用

siRNA和shRNA提供的目标特异性使得它们作为治疗和诊断工具在医疗用途中前景广泛。它们已被用于锁定癌基因如Bcl-2、p53,以及携带致癌缬氨酸-112突变的k-ras基因。siRNA组合对抗癌细胞内多个目标也有一些令人满意的成果。 siRNA治疗方法在小鼠神经系统疾病模型,如亨廷顿氏病中是有效的方法。除了在遗传疾病中,RNA干扰还被测试作为针对病毒感染的潜在治疗方法。治疗黄斑变性,糖尿病性视网膜病,丙型肝炎的临床试验正在进行中。然而,仍然存在一些障碍需要克服。正如在体外观察到的那样,引入dsRNA激活免疫反应可能会表现很强的毒性,并抑制干扰效果。此外,确保转运到靶组织的有效系统也需要加以改进。




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发表于 2016-10-28 18:24:52 | 显示全部楼层
shRNA是small hairpin RNA ,短发夹RNA,h指的是hairpin
根据siRNA 靶序列,设计 siRNA 正义链和反义链,以 loop相连,称为 shRNA(short hairpin RNA),shRNA就是设计成发卡样的siRNA。
构建shRNA的表达载体可以在细胞内直接转录出 shRNA ,生成相应的siRNA,其干扰效果等同于siRNA ,而且能够解决 siRNA干扰时间短的缺点。
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