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用ZFN这个基因编辑技术来得到一个突变的细胞系成功率!

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发表于 2016-10-29 23:32:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
成功率低的有点可怜!
Although the efficiency of ZFN KO varied among cell lines at 1.3%, 0.5%, and 3.6% for MCF7, MDA-MB-231, and HEK293T, respectively, the average KO efficiency across all clones analyzed was 1.2%
还要设计一堆实验来验证的确做到了完全敲除。
参考文献:CARM1 Methylates Chromatin Remodeling Factor BAF155 to Enhance Tumor Progression and Metastasis



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你这个问题很复杂,需要打赏,请点击 http://www.bio-info-trainee.com/donate 进行打赏,谢谢
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发表于 2016-11-1 18:21:53 | 显示全部楼层
本帖最后由 learnyoung 于 2016-11-1 18:25 编辑

在基因编辑方面锌-指(Zn Finger Nuclease,ZFN)法算是一种比较老的方法了,目前基因编辑的方法有ZFN,TALEN,和最近几年大火的CRISPR-Cas9。当然更久之前运用的是同源重组的方法,但是效率实在是太低了。同源重组之后就是ZFN了,再往后就是TALEN法了,TALEN法和ZFN一样分为两个结构单元,一个是识别模块另一个是切割模块(FokⅠ酶),ZFN的识别单元是锌-指这个特殊结构,而TALEN的识别单元是由34个氨基酸组成。其中12和13位的氨基酸是可变的,即每34个氨基酸可以对应识别一个碱基。这个方法最大的一个缺点就是工作量很大,每34个氨基酸对应一个碱基,想要敲出一个基因对于普通实验室来说相对非常麻烦,因此也一直是外包给公司做。(了解原理就可以了,反正也不用这个方法,因为有更好用的
下面重点介绍一下CRISPR-Cas9了:
CRISPR-Cas9最大的优点就是简单方便,普通实验室就可以做。比如我们实验室。
需要的材料和技能:
1,gRNA
2,质粒(lentiCRISPR v2)
3,基本的分子生物学实验技能(转化)
完了,简单不?
大概流程:
1.上NCBI找到你要敲出的基因
2,设计gRNA(可以到一些网站上自动设计,或者自己手动设计,推荐到网站上设计,简单方便,亲测结果蛮好。下面也有介绍到手动设计)
3,gRNA交给公司合成
4,将gRNA克隆岛载体(我用的lentiCRISPRV2)上
5,转化到目的细胞
6,刷选:lentiCRISPRV2(张锋实验室弄出来的)有抗性基因氨苄青霉素加入即可帅选出敲出了某基因的细胞,可以做一个WB检测一下。
(先写到这里吧,CRISPR的原理和质粒需要放很多图,但是论坛放入片很不方便)
C:\Users\learn young\Desktop
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发表于 2016-11-2 10:27:51 | 显示全部楼层
管理员不知道想要表达什么
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