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KO某个基因后,做mRNA-seq或者芯片,表达值就为0吗?

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发表于 2016-11-14 10:42:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
敲除某个基因的方法有不少,ZTF,TLEN,CRISPR
降低基因表达的方法也有不少,sh,si,ngago
方法的不同,对目的基因表达的影响就不同,效率也不一样。

我们通常说KO掉某个基因,指的是?mRNA水平还是蛋白水平?
我看了一个AMPK DKO ESC lines,就是把ampk这个蛋白复合物的prka-a1基因ko掉,我发现它的RNAseq数据仍然有表达mRNA,而且WT跟KO相差并不大
The following human genes encode AMPK subunits:


数据见:直接分析处理好了的RPKM值:ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE77nnn/GSE77705/suppl/GSE77705_RPKM.xlsx
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77705








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 楼主| 发表于 2016-11-14 11:03:35 | 显示全部楼层
主要的目的是利用细胞自身的修复机制的缺陷,在切口处引入突变,然后导致的基因功能丧失!
但是基因功能丧失不一定是它不能转录,可以是转录以后无表达,或者转录以后影响剪接,或者氨基酸序列变了,或者提前终止了等等,总之,就是正常的靶蛋白没有了!
如果要想使得该基因无法转录,需要设计该基因的启动子区域的KO实验,对于启动子,KO后Poly ii结合不上去,基因就不会转录了;KO中间的区域,前面部分会有reads,后面部分也会有reads,因为RNA聚合是根据终止信号来终止的,基因有表达量,但最终蛋白是否完整,还是需要实验验证!因为翻译的时候,可能移码了,或者提前遇到终止密码子了,即使一切正常,也会出现一个怪异蛋白,不一定有功能
而且还得考虑该基因的同源基因和假基因情况,不过可以通过去除multiple mapping reads来防止这个情况!


如果要想验证该基因是否被KO,需要做基因组PCR,但是我不懂是什么。

接下来就是从数据的角度来理解KD是什么了~
KD做RTPCR


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