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测序仪比较之Miseq Vs PGM

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发表于 2017-2-23 14:03:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
前几天用了PGM的机器来测序,发现结果出现了比较多的插入部分(相比Miseq),于是寻求答案,对PGMMiseq进行对比。
1.技术原理
Miseq荧光边合成边测序,检测DNA聚合过程中的荧光信号,单次测序反应,只延伸一个碱基。目前,该原理已成为高通量行业金标准
PGM:离子半导体测序,检测DNA聚合过程中释放的H+,即通过检测反应体系中PH的变化获取碱基信息。当进行一轮测序反应时,每加入一种dNTP,可以进行单一碱基或多个重复碱基的延伸,当遇到多聚碱基序列时,将进行持续延伸,直到遇到与该dNTP不能互补的碱基为止。
2. 重复连续碱基检测
Miseq:使用边合成边测序(SBS)的原理,由于每一轮测序只延伸一个碱基,完全不存在重复连续碱基的读取问题。
PGM:检测氢离子过程中,当遇到多聚碱基时,一次测序循环进行多个碱基的延伸,产生的信号不能准确读取是几个连续碱基,产生系统误差
这就是为什么用PGM测量的数据有很多insert的缘故,我发现大部分insert都是polyA的时候,多个连续的A,会导致不能准确读取是几个连续碱基,产生系统误差
3. 测序覆盖均一性
Miseq
1)大量科学文献验证,可以提供极佳的全序列范围的覆盖
2)新推出的PCRFree的文库制备试剂盒,更可以显著提升可能在文库制备过程中由于PCR扩增所造成的,各个平台都存在的,GC富集区域的覆盖问题。
PGMAT富集区覆盖度严重不均一,造成AT富集区覆盖度低,无法准确获得该区域的遗传信息。无针对ATGC富集区解决策略
4. 双端测序
Miseq:支持读长为2X300bp的双端序列,双端测序支持更广泛的应用,研究人员利用双端测序开发当前热点应用Hi-C,基因融合等。
PGM:未能提供双端测序方案,RNA-seq 可变剪切、de nove测序、Hi-C,基因融合等大量应用受到限制
5. 测序读长
Miseq:支持2x300bp读长,可获得高质量的接近600bp的连续读长,对于16SrRNADe novo 测序,HLA分型等需要长读长的应用提供极大的帮助。后续将升级2X400bp 长读长的试剂。带来更广泛的应用。
PGM:最长支持单端400bp读长试剂盒,由于其测序片段长短不一,400bp试剂读长分布在峰值在400bp附近,而平均读长只能达到300bp左右。这种长短不一的片段,会引来数据数据分析的复杂度。
6. 数据通量
Miseq:支持单次测序reads数:1M-25M,通量:150Mb-15Gb。支持不同通量的芯片如NanoMicroV2V3 等芯片。更广泛的通量范围,满足更广泛的样本需要,可根据实验所需通量,灵活选取合适芯片
PGM:支持的单次测序reads数: 0.5M-5Mreads,通量:200MB-2Gb 支持的最大数据通量仅为2G,可检测的样本量小,单位数据量成本高,成本约为MiSeq5倍以上。
7. 应用灵活性
Miseq:支持6种不同模式的读长,四种不同reads数的芯片(Nano,Micro,V2,V3),通量范围从150M-15G,更广泛的通量 和读长范围,可根据项目周期和最优成本灵活安排各类应用。
PGM:支持2种不同模式的读长,三种不同reads的芯片(314316318),通量范围从200M-2G,通量低,多数应用受限,如RNA-Seq,外显子测序等应用无法开展。
8. 单次运行支持的样本量
Miseq:支持384个样本标签。最多可支持384个样本标签,对于需要大量样本量的研究,单次可完成大量样本的检测,可显著提高项目的进度,同时可显著降低单个样本的成本。
PGM:支持96个样本标签。 1)超过96个样本标签需要客户自己合成,难以保证质量和稳定性。 2)可支持单次检测的样本量少,单位样本成本高。
9. 运行速度
Miseq
1. 全部实验流程:构建文库(3 hrs+模板制备(3 hrs)+测序(52hrs)=15G/58hrs,
2. 每小时产生数据:0.26G。单位时间产生的数据量为PGM2.2
PGM
1. 全部实验流程:构建文库(3 hrs+模板制备(7hrs)+测序(7.3hrs)=2G/17.3hrs,
2. 每小时产生数据:0.12G
10. 仪器稳定性
Miseq
系统集成度高,试剂盒配置封闭的试剂板、buffer板,操作简单、受外界环境影响小。边合成边测序法(SBS)产生数据质量稳定且准确性高。
PGM
稳定性低,系统集成度低,需要大量手工试剂和buffer的配制,操作复杂,容易受到环境中二氧化碳、温度、水质等因素影响造成测序环境中PH的变化,从而影响数据的产出和质量。
11. 系统一体化程度
Miseq
单一仪器,模板制备、碱基测序及信号转化及数据存储都在一台机器上完成,一体化程度高。
PGM
1)系统复杂度高,模板制备(EmulsionPCR)需要两台独立的机器,One Touch2 One Touch ES 系统。
2)序列信号转化需要配置专门的服务器进行计算。
3)测试仪需要大量辅助设备,如DNA破碎仪,纯水,氮气钢瓶等。
12. 操作的简便性
Miseq
模板放大(簇生成)以及测序过程都可以在集成的自动化测序系统上完成,实现了真正意义上的一键式操作。
PGM
模板放大(Emulsion PCR)及测序为独立的三台仪器,自动化程度低,操作过程手动步骤多。如模板放大设备分为两个仪器,One Touch2 One ESOne Touch2 PCR实验后需要约1小时手动操作过程, 再转移到One TouchES系统上。之后, 需要手动芯片点样, 操作复杂且操作失败率高。
13. 平台的扩展性
Miseq
扩展性强,上市以来,通量经历了1G7.5Gb再到15Gb的升级,读长经历了2x100bp2x300bp的升级。后续读长有升级2x400bp的计划。
PGM
扩展性弱,经过4年的发展,最大通量只从1G升级到2G,读长只支持200bp400bp模式。通量已达到极限,更大通量需求,需要再购买新的大通量仪器。
14. 数据生成
Miseq
无需专用服务器转化碱基信号,采用标准的Fastq格式,三方软件标准格式。
PGM
1)测序信号复杂度高,需要配置专用服务器转化碱基信号。
2)生成数据格式为不是常规数据格式.sff,不兼容三方软件,只支持自带软件,限制应用的广泛性。
3)产生长短不一的reads,会引来数据分析的复杂度。
15. 支持应用的广泛性
Miseq
支持更广泛的应用,从小物种如病毒、细菌等基因组的检测,到大物种如人的RNA-Seq、外显子测序等应用都可以使用MiSeq 平台进行测序。
PGM
不适合大型、中型物种及大样本的项目,如果动物、人的RNA-Seq,外显子测序及大量的样本的16S rRNA测序等应用。
16. 参考文献
   Loman NJ1, Misra RV, Dallman TJ, Constantinidou C, Gharbia SE, Wain J,Pallen MJ.Performance comparison of benchtop high-throughput sequencingplatforms.Nat Biotechnol. 2012 May;30(5):434-9. doi: 10.1038/nbt.2198.
   Elliott AM1, Radecki J, Moghis B, Li X, Kammesheidt A.Rapid detection ofthe ACMG/ACOG-recommended 23 CFTR disease-causing mutations using ion torrentsemiconductor sequencing.J Biomol Tech. 2012 Apr;23(1):24-30. doi:10.7171/jbt.12-2301-003.
   Quail MA1, Smith M, Coupland P, Otto TD, Harris SR, Connor TR, BertoniA, Swerdlow HP, Gu Y.A tale of three next generation sequencing platforms:comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeqsequencers.BMC Genomics. 2012 Jul 24;13:341. doi: 10.1186/1471-2164-13-341.



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发表于 2017-2-23 14:51:10 | 显示全部楼层
我怎么发现,你前面的排版要好一点呀,还有各种颜色高亮,你这个反而平淡无奇
你这个问题很复杂,需要打赏,请点击 http://www.bio-info-trainee.com/donate 进行打赏,谢谢
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 楼主| 发表于 2017-3-24 14:42:19 | 显示全部楼层
Jimmy 发表于 2017-2-23 14:51
我怎么发现,你前面的排版要好一点呀,还有各种颜色高亮,你这个反而平淡无奇 ...

丁鹏(未变黑的古天乐饰)出来的时候也是被龙套评价:我看此人平平无奇~~

前面排版炫所以玩歪了,字都是乱的
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