芯片基础知识打卡

ydchen

高通量、全基因组的DNA芯片已经成为生物领域十分有用的工具。然而，芯片实验产生的数据量日益增长，由于不同的分析方法，会得出不同结论，因而分析起着关键作用。

基因芯片分析就是为了通过生物信息学方法从这些芯片数据中发现可能对生物效应起作用的关键基因，从中寻找特定模式并对每个基因给予注释，从而挖掘出隐含的生物学过程并抽提出生物学的或功能层面上的意义。

根据芯片的使用目的，一张芯片可能包含数十、数百甚至数十万的不同序列。被排列成矩阵的DNA片段通常称为探针，而样本RNA则被成为靶标。

基本的芯片实验中，样本mRNA首先被反转录成cDNA（在过程中同时被荧光标记），后与芯片上的核酸探针混合，互补杂交的cDNA就结合到芯片上，而未被杂交的样本被洗脱掉。

芯片被一个荧光扫描仪扫描后，芯片上某个位置探针结合上了样本中互补的核酸，就在该位置显出了一个荧光点，此位置提示基因的身份，而荧光强度则提示了原始样本中该mRNA水平的高低。芯片技术不只用于检测基因表达，也可以用于检测单核苷酸多态性等。

在芯片技术中有两种基本方法：单染色技术和双染色技术。单染色技术是将一个样本经一种荧光标记后单独杂交的一张芯片上，是目前使用最多的方法。将一个样本单独与一张芯片杂交，可以方便简单地在多张芯片之间进行比较。产生的芯片数据为单通道信号数据，这种方法产生的数据变异大，需要通过重复实验来减少误差。

双染色技术是把两个样本用不同荧光标记后一起杂交到同一张芯片上。用于检测两种不同条件下基因表达的差异情况，如疾病组织和正常组织（往往多个正常组织DNA混合在一起，作为”pool“样本）；处理组与对照组。两个样本（如处理与对照）被两种不同荧光标记。一个样本的cDNA用Cy5（一种显示为红色染料）标记，另一个样本用Cy3（一种显示为绿色的染料）标记。这两种荧光标记的样本混合后与芯片上的探针竞争杂交。

这样产生的芯片数据为双通道信号数据。这种双通道信号数据便于两样本间的直接比较，有助于减少数据变异性，提高组间差异表达分析的准确性，同时减少了芯片的使用量，节约了成本。但由于使用这种技术已经确定好了实验设计，就无法与其他样本进行比较了。

当前，市场上芯片主要来自三家公司：Affymetric公司、Agilent公司和Illumina公司。
基因芯片分析

软件介绍

基因芯片分析一般对硬件要求不高，普通的计算机就能运行，但如果处理较多的数据量时，建议提高内存，一般拥有16g内存和i7的处理器基本就能快速运行所有分析了。目前基因芯片的分析工具很多，但各有优缺点。根据难易程度推荐以下三款软件和工具。

1. GeneSpring 优点：互动式的视窗操作界面，傻瓜式操作，功能强大，拥有超过4400篇的高水平参考文献的引用，表达谱数据分析的金标准。缺点：商业软件收费，操作繁琐，功能拓展性差。如同SPSS一样，适用于零基础。

2. BRB-Array 优点：基于excel的分析工具，自动调用R包，功能强大，拓展性强，操作简单，免费使用。缺点：专业性强，格式要求高，稍有不符就报错。适用于有一定专业基础。

3. R-Bioconductor 优点：R语言，生信必学的分析工具，强大的统计分析和作图工具，集合了几乎所有最新的分析算法和工具包，免费下载使用。缺点：需要有一定计算机编程能力。

数据下载

一般来说要比较和整合不同实验室和不同实验的数据是比较困难的。因此，科学家成立了一个联盟（MGED学会）来规范化芯片数据的输出和注释，促进数据共享和统一数据库的建立。

指定的标准化规则称为MIAME，权威期刊一般只接受遵循MIAME规则的芯片数据论文。NCBI的GEO和EBI的ArrayExpress是目前最大的公开资源数据库，用于存储和发布与MIAME相容的芯片数据。

ydchen

提取生物样品的mRNA并反转录成cDNA，同时用荧光素或同位素标记。在液相中与基因芯片上的探针杂交，经洗膜后用图像扫描仪捕获芯片上的荧光或同位素信号，由此获得的图像就是基因芯片的原始数据（raw data），也叫探针水平数据。

获取探针水平的数据是芯片数据处理的第一步，然后需要对其进行预处理（pre-processing），以获得基因表达数据（gene expression data）。基因表达数据通常用矩阵形式表示，称为基因表达矩阵。

基因表达矩阵的每一行代表一个基因的表达量，一列代表一个样本的所有基因的表达情况。


一
背景（background）处理

背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。一般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的平均值作为背景。

但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点，同时会使1％～5％的点产生无意义的负值。也可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或综合整个芯片非杂交点背景所得的平均值做为背景。

Brown等提出利用整个芯片杂交点外的平均吸光度值作为背景的best-fit方法，使该问题得到较好的解决，并有效地提高了处理数据的质量。背景处理之后，我们可以将芯片数据以矩阵的格式输出。


二
数据筛选

经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，显然负值是没有生物学意义的。数据集中还可能包括一些单个异常大（或小）的峰（谷）信号，它们被认为是随机噪声。另外，对于负值和噪声信号，通常的处理方法就是将其去除。

然而，数据的缺失（除了上述原因会造成数据缺失以外，扫描的过程中也可能会产生缺失）对后续的统计分析（尤其是层式聚类和主成分分析）有致命的影响，所以在进行分析前需要数据筛选。数据筛选的步骤是先筛选点样，然后是数据标准化、截断异常值，最后筛选基因。


1 点样筛选

点样筛选指在单独芯片上对点样进行筛选，主要用于质量控制目的，以去除“坏”点样。与基因筛选不同的是，点样筛选并不会去除整个（行）基因，而只是用以缺失值替换原有值。可以根据信号强度（intensity），点样标志（Spot Flag）和点样大小（Spot size）来进行筛选。

信号强度筛选：一个点样可以被直接剔除，也可以通过设定阈值在分析中剔除。阈值一般设定为正值。

点样标志筛选：筛选可以同时使用数值和字符。可以指定一个数值范围，在此范围之外的值被剔除，或指定一个基因列表来表示要剔除的点。

例如Affymetrix芯片专门对每个表达值进行了打分（A,M,P三类），以允许用户剔除标识为“A”（Absent）的表达值，以剔除含有“A”较多比例的“坏”探针。


2 数据标准化

在芯片实验中，各个芯片的绝对光密度值是不一样的，在比较各个芯片结果之前必需将其归一化（normalization，也称作标准化）。在同一块芯片上杂交的、由不同荧光分子标记的两个样品间的数据即双通道数据，也需归一化。

目前有4个常用的标准化方法：中位数标准化（median normalization）、管家基因标准化（housekeeping gene normalization）、Lowess标准化（lowess normalization）和点样组内标准化（print-tip group normalization）。

前二者适用于单/双通道数据，二后两者只能用于双通道数据。对于单通道数据，必须选择一张参照芯片以使其它芯片进行标准化。双通道数据中每张芯片需进行单独的标准化。

参照芯片一般是一张“中位数”芯片作为参照，选择的方法如下：
1） 设N为实验数，i为1到N中的一个数。
2） 对于每张芯片i，计算其对数信号强度的中位数：Mi。
3） 从{M1,....,MN}中获得其中位数M。如果N是偶数，则M为中间两数中较小的那个。
4） 选中的那个Mi即为参照芯片。

中位数标准化（Median Normalization）对于双通道数据来说，这种标准化方法就是将每张芯片上的对数值减去各自芯片上对数比值的中位数，这样该芯片的对数比值中位数就变成了0。

对于单通道数据，首先在待标准化的芯片与参照芯片上的每个对应基因上计算差值，然后在待标准化的芯片上减去该差值的中位数，以使两者间的总差值为0。

管家基因标准化（HouseKeeping Gene Normalization）选择一组表达水平稳定的管家基因。

对于双通道数据而言，该方法通过把待标准化芯片上的所有对数比值减去该芯片管家基因对数比值的中位数来进行。对于单通道数据，则比较待标准化芯片和参照芯片上管家基因的差值，然后把待标准化芯片上的信号强度减去这一系列差值的中位数。

但目前很难找到理想的看家基因，研究表明，所谓“管家基因”在不同实验条件下其表达水平同样发生着变化。

Lowess标准化（Lowess Normalization）双通道数据还可用Lowess标准化方法（Locally Weighted Scatter plot Smooth：局部加权线性回归）。

对于双通道数据，中位数标准化相当于在所有对数比值上减去一个相同的标准化因子即该芯片上对数比值的中位数，但在某些情况下并不适用，例如由于染色偏差会对低信号强度和高信号强度产生偏差。

在Lowess标准化中，会基于一个非线性的平滑函数观察标准化后芯片的M-A散点图来决定是否有必要进行强度依赖性的标准化。如果散点的分布在Y轴的正负区间大概一致，并且随着X值的变化没有呈现出典型的相关性，则无需进行。

该函数是根据重叠分割在不同X轴区域上的散点而构造的线性回归函数连接而成。待标准化的芯片减去该平滑函数值来进行标准化。

点样组内标准化（Print-tip Group / Sub Grid Normalization）全局化的标准化方法由于受空间效应和非均匀点样给信号强度带来的影响会造成系统偏差。点样组内标准化方法就是考虑上所述的系统偏差对其进行调整。

点样组（Print-tip Group）亦可称为网格（Grid）或亚网格（Sub-grid）。点样组标识数据一般放置在每张芯片的表达谱数据后面。中位数点样组内标准化独立地计算每个点样组内的对数比值的中位数，该中位数当然只适用于点样组内的数据。

举例来说，如果一张芯片由16个点样组构成，则会计算16个标准化因子。同理，Lowess点样组内标准化是把之前所述的Lowess标准化方法应用于点样组内。


3 截断（Truncation）异常值

设置信号强度（单通道数据）或强度比值（双通道数据）的最大允许值。任何大于此阈值的数值会被截断成阈值。对于双通道数据则会出现两种情况（如设定截断值为64，则任何大于64或小于1/64的数值都会被截断）。

截断主要用于双通道情况，因为微小的分母容易使对数比值变得异常巨大。


4 基因筛选

不同于点样筛选，基因筛选并不是对每张芯片重复进行，而是在所有芯片上对某个基因制定一个标准，以决定是否保留需要保留这个基因。基因筛选的目的并不在于去除质量较差的点样，而在于筛除那些信息量较少的基因。主要由最小倍数变化筛选（Minimum fold-change filter），对数表达量方差筛选（Log Expression Variation Filter）和空缺百分比筛选（Percent Missing Filter）三种。

最小倍数变化筛选是将差异性较小的基因可去除。此处筛选的标准基于以下条件：满足表达量在所有芯片上表达量中位数相差指定倍数的基因的个数，占总基因个数的比例。小于上述比例的基因则被筛去。这种筛选并非必要，往往是为了应对内存不足的分析条件下，例如内存要求随基因数迅速增长的聚类分析。

对数表达量方差筛选是剔除方差最小的比例基因，即所有基因的方差会被与方差中位数进行比较，差异并不显著的基因会被筛去。同样这种筛选也非必要，往往为了应对内存不足的情况。

空缺百分比筛选是对单个值的点样筛选后缺失值的最大比例设定阈值，以去除那些包含了太多缺失项而被认为不可靠的基因。一般超过50%就删除整行的基因表达值。

ydchen

摘要
基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考.

关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析

吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析. 世界华人消化杂志 2006;14(1):68-74
http://www.wjgnet.com/1009-3079/14/68.asp

0 引言
基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析; (3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法.

1  差异基因表达分析(difference expression, DE)
对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分析, 具体方法包括倍数分析、t检验、方差分析等.
1.1 倍数变化(fold change, FC) 倍数分析是最早应用于基因芯片数据分析的方法[4], 该方法是通过对基因芯片的ratio值从大到小排序, ratio是cy3/cy5的比值, 又称R/G值. 一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异, 该范围之外则认为基因的表达出现显著改变. 由于实验条件的不同, 此阈值范围会根据可信区间应有所调整[5,6]. 处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出, 如柱形图、饼形图、点图等. 该方法的优点是需要的芯片少, 节约研究成本; 缺点是结论过于简单, 很难发现更高层次功能的线索; 除了有非常显著的倍数变化的基因外, 其它变化小的基因的可靠性就值得怀疑了; 这种方法对于预实验或实验初筛是可行的[7]. 此外倍数取值是任意的, 而且可能是不恰当的, 例如, 假如以2倍为标准筛选差异表达基因, 有可能没有1条入选, 结果敏感性为0, 同样也可能出现很多差异表达基因, 结果使人认为倍数筛选法是在盲目的推测[8,9].
1.2 t检验(t-test) 差异基因表达分析的另一种方法是t检验[10], 当t超过根据可信度选择的标准时, 比较的两样本被认为存在着差异. 但是t检验常常受到样本量的限制, 由于基因芯片成本昂贵, 重复实验又很费时, 小样本的基因芯片实验是很常见的, 但是小样本导致了不可信的变异估计. 为了克服这种缺点, 研究者提出了调节性t检验(regularized t-test), 它是根据在基因表达水平和变异之间存在着相互关系, 相似的基因表达水平有着相似的变异这个经验, 应用贝叶斯条件概率(贝叶斯定理)统计方法, 通过检测同一张芯片临近的其它基因表达水平, 可以对任何基因的变异程度估计进行弥补. 这种方法对于基因表达的标准差估计优于简单的t-test和固定倍数分析法[11].
1.3 方差分析(analysis of variance, ANOVA) 方差分析(ANOVA)又称变异数分析或F检验, 其目的是推断两组或多组资料的总体均数是否相同, 检验两个或多个样本均数的差异是否有统计学意义, 方差分析可用于差异基因表达研究[12]. 方差分析需要参照实验设计, 参照样本常用多种细胞的mRNA混合而成, 由于所有的细胞同时表达的基因众多, 结果低表达基因在样本混合后就被稀释而减少了参照样本的代表性, 因此, 增加参照样本的细胞不会提高参照样本的代表性[13].
    方差分析能计算出哪些基因有统计差异, 但它没有对那些组之间有统计差异进行区分, 比如用单因素方差分析对A、B、C、D 4组进行分析, 对于某一个基因, 方差分析能够分析出A组与B、C、D组之间有差异, 但是B、C、D之间无统计学意义. 这就需要使用均值间的两两比较(post-hoc comparisons)检验, 该检验是对经方差分析后的基因进行下一水平更细节的分析[14]. 即t-检验只能用于检验两样本中均值是否存在显著性差异, 而两两比较技术考虑了多于2样本间均数的比较.
    上述所有的参数分析方法必须平衡假阳性、假阴性错误[15,16], 控制假阳性率有4种方法: (1)邦弗朗尼(Bonferroni)方法, 计算公式: Corrected P-value ＝ P-value×n(number of genes in test), 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因. (2)Bonferroni Step-down(Holm)法, 这种校正方法与邦弗朗尼很相似, 但没有前者严格. 主要思想如下: 每个基因的P值从低到高排序, Corrected P-value＝P-value×n(n-1/n-2……), 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因. (3)Westafall &Young参数法, 前面2种方法都是单独对P值进行纠正, 本方法通过同时对所有基因进行排序, 充分利用基因间的独立性进行P值纠正. 每个基因的P值是按原始资料的排序进行计算; 将资料划分为人工组和对照组而产生新的数据. 采用新数据计算所有基因的P值, 新P值再与以前的P值进行比较, 上述过程重复很多次, 最后计算出纠正P值. 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因. (4)Benjamini & Hochberg假阳性率法, 该方法是4种方法中最不严谨的方法, 因此可能产生很多的假阳性和假阴性, 其方法如下: 首先对每一个基因的P值由小到大排序, 最大的P值保持不变, 其它基因按下列公式计算P值, Corrected P-value ＝ P value×(n/n-1)以此类推, 若P<0.05则为有差异基因.
    上述前3种方法可概括为误差率判断族(family-wise error rate, FWER), 它的特点是允许很少的假阳性基因发生, 而假阳性率(false discovery rate, FDR)是允许一定率的假阳性基因发生. 总之, 假阳性率(FDR)在差异表达与控制假阳性率之间提供了一个好的平衡统计, Bonferroni是最严格的方法, 也是最保守的假阳性估计方法. Westfall & Young参数法是以基因的共同调节进行计算, 因此它的计算是很慢的, 对假阳性率的估计也是很保守的[17,18].
1.4 非参数分析(nonparametric analysis) 由于微阵列数据存在＂噪声＂干扰而且不满足正态分布假设, 因此使用t-检验和回归模型进行筛选的方法可能有风险. 非参数检验并不要求数据满足特殊分布的假设, 所以使用非参数方法对变量进行筛选虽然粗放, 但还是可行的[19]. 目前用于基因表达谱数据分析的非参数方法除了传统的非参数t-检验(nonparametric t-test)、Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sun test)等外[20], 一些新的非参数方法也应用于基因表达谱数据的分析中, 如经验贝叶斯法(empirical Bayes method)[21]、芯片显著性分析(significance analysis of microarray, SAM)[22]、混合模型法(the mixture model method, MMM)[23]等. 参数法的缺点是分析数据有假设检验, 比如改变样本中的变异可明显影响分析结果, 对同样数据的转换(如对数), 对其分析结果也有明显的影响. 非参数方法对于这种情况的发生更有效, 但是它对表达数据分析的敏感性不如参数方法.
1.5 回归分析(regression analysis) 目前使用的一些简单的参数分析方法是通过数据转换(如对数)来达到正态分布为假设前提的, 或者是估计的经验分布, 然而这二种方法对基因表达数据可能都是不合理的, 非参数方法忽视了数据的分布, 而参数方法又会误判数据的分布[24,25]. 基因表达谱的回归分析是可以处理多个基因变量间线性依存关系的统计方法, 于是研究者们提出了使用回归分析基因表达谱数据, 如Li et al[26]使用互变量(Cox)回归方法分析基因表达谱数据, 用于患者的生存率预判; Huang et al[27]将线性回归方法应用于肿瘤的分类研究中.
   
2  聚类分析(clustering analysis)
组聚类分析的目的在于辨别在某些特性上相似的事物, 并按这些特性将样本划分成若干类(群), 使同类事物具有高度同质性, 而不同类事物则有高度异质性. 聚类分析是通过建立各种不同的数学模型, 它把基于相似数据特征的变量或样本组合在一起. 归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联, 从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能. 但是由于使用数据转换、归一化等因素, 导致对聚类分析结果的影响较大; 此外, 聚类只是为了寻求类, 不管所聚的类别是否有意义[28].
2.1 分层聚类法(hierarchical clustering, HCL) 分层聚类是将n个样品各作为一类, 计算n个样品两两之间的距离, 构成距离矩阵, 合并距离最近的两类为一新类, 计算新类与当前各类的距离[29]. 再合并、计算, 直至只有一类为止. 分层聚类是第一个被应用于基因表达谱数据分析的聚类方法[30], 由于结果的可视化和基因间关系的明确表现, 广泛地应用于基因表达谱的肿瘤亚型分类和幸存率研究中[31,32].
2.2 K-均值聚类(K-means clustering, KMC) K-均值聚类是先选择初始凝聚点, 根据欧氏距离系数, 将每个样品归类, 各类的重心代替初始凝聚点, 根据欧氏距离将每个样品不断地归类, 直至分类达到稳定. K-均值算法是采用误差平方和为准则函数的动态聚类方法, 其计算快速, 适合于大规模的数据计算[33]. 如D'ambrosio et al[34]为了理解肥大细胞增生的分子机制和寻找其鉴定的分子标记, 选取肥大细胞增生症患者和正常人的骨髓的单核细胞进行基因芯片实验, 应用K-均值聚类和分层聚类得到同一类的10个基因, 进一步分析鉴定出3个基因属于该疾病的候选标记基因. 但是K-均值聚类也有不足之处, 它对初始凝聚点比较敏感, 如果初始凝聚点没有选择好就可能集合在标准功能值的局域极小值上. 而另一个问题在于它是完全无结构的方法, 聚类的结果是无组织的[35].
2.3 自组织映射图网络(self-organizing map clustering, SOM) 神经网络中邻近的各个神经元通过侧向交互作用彼此相互竞争, 自适应地发展成检测不同信号的特殊检测器, 这就是自组织特征映射的含义. 其基本原理是将多维数据输入成几何学节点, 相似的数据模式聚成节点, 相隔较近的节点组成相邻的类, 从而使多维的数据模式聚成2维节点的自组织映射图. 自组织映射图允许对类进行调整, 属于监督类聚类[36]. 自组织映射图分类标准明确; 优化的次序好于其它聚类法, 在基因表达谱的数据分析中得到广泛的应用. 如Covell et al[37]认为多种肿瘤可能具有共同的基因表达谱, 他们选取了14种肿瘤和正常对照组织进行基因表达谱研究, 结果自组织图能完全将肿瘤和正常组织区分出来, 自组织图对各种肿瘤的分辨率达到80%的准确性, 其中对白血病、中枢神经系统肿瘤、黑色素瘤、子宫癌、淋巴瘤有很好的判别作用, 对直肠癌、乳腺癌、肺癌的判别差.
2.4 双向聚类(two-way clustering, TWC) 基因表达谱常采用单向聚类法(one-way clustering), 即要么以整个样本中特性相似的基因进聚类, 或者以基因表达相似的样本进行聚类. 对样本和基因同时进行聚类就是双向聚类法(two-way clustering)[38], 目前基因表达谱的数据分析常用的双向聚类有基因剃须(gene shaving, GS)和格子模型(plaid models). 基因剃须是通过基因的共同表达值或表达量来鉴定基因的亚类, 基因表达谱分析方法常用监督进行聚类, 没有考虑一个基因可能属于多个类. 基因剃须对基因或样本进行分类既可以是监督的, 也可以是非监督的. 基因剃须近年逐渐被应用于基因表达谱的分析中, 如Hastie et al[39]使用基因剃须方法分析了B细胞淋巴瘤患者的基因表达谱, 鉴定了一小类可用于生存率预判的基因. 作者认为基因剃须方法是一种潜在有用的基因表达谱数据分析方法. Jiang et al[40]使用了2种基因剃须方法筛选肺腺癌的标志基因, 通过和正常组织的基因表达谱比较, 分别筛选到13条和10条, 其中5条是共同的. 格子模型的目的是分析基因芯片数据可解释的生物结构, 即基因或样本的亚类. 各类之间可以进一步聚类, 从而获得稳定的、有意义的分层结构[41,42]. 目前应用格子模型进行基因表达数据分析的实例还不多.
2.5 混合聚类法 所谓混合聚类就是先非监督(unsupervised)聚类再监督(supervised)聚类. 其优点是可以整合多种聚类方法的优点, 目前混合聚类受到越来越多研究者的关注, 如由于基因芯片数据的复杂性和多维性, 为利于基因表达谱数据的处理, 有必要对复杂多维的原始数据进行简化处理, 为了解决这个问题, Wang et al[43]提出了双水平分析, 即首先使用自组织图减少原始数据的多维性, 然后进行了K-均值和分层聚类以建立样本判别的基因表达模型. Herrero et al[44]还论述如何将自组织图和分层聚类组合成一个优秀的工具用于基因表达谱的数据分析.

3  判别分析(discriminant analysis)
判别分析能够依据样本的某些特性, 以判别样本所属类型. 与聚类分析不同的是, 判别分析是用某种方法将研究对象分成若干类的前提下, 建立判别函数, 用以判定未知对象属于已知分类中的哪一类. 基因判别分析(有监督学习)是在已有数据的基础上建立分类器, 并利用所建立的分类器对未知样品的功能或状态进行预测[45,46]. 目前使用的判别分析方法主要有: 支持向量机、决策树、贝叶斯分类、神经网络法等.
3.1 费希尔判别分析(fisher discriminant analysis, FDA) 费希尔判别分析是以线形函数为准则进行判别[47], Cho et al[48]应用费希尔判别方法分析肿瘤患者的基因表达谱资料以判别肿瘤的分型. 如Dangond et al[49]将费希尔判别方法应用于计算肌萎缩侧索硬化病的基因表达谱研究中.
3.2 贝叶氏网络(bayesian networks) 也被称为因果网络(causal networks), 是描述数据变量之间依赖关系的一种图形模式, 是一种用来进行推理的模型. 贝叶斯网络为人们提供了一种方便的框架结构来表示因果关系, 这使得不确定性推理在逻辑上更为清晰、更好理解[50]. 如Imoto et al[51]结合贝叶斯网络和生物学知识进行基因表达谱数据的基因网络分析, 并以酿酒酵母的基因表达谱数据为例进行了论证. Kim et al[52]将贝叶斯网络法应用于时间系列的基因表达谱数据的基因网络分析等.
3.3 支持向量机(support vector machines, SVMs) 支持向量机是数据挖掘中的一个新方法. 支持向量机能非常成功地处理回归问题(时间序列分析)和模式识别(分类问题、判别分析)等诸多问题, 它通过训练一种＂分类器＂来辨识与已知的共调控基因表达类型相似的新基因[53-55]. 例如Williams et al[56]为了鉴定出肾母细胞瘤复发的基因表达谱模型, 研究了27例肾母细胞瘤患者的肿瘤组织, 其中13例2 a内复发, 对复发和未复发的肿瘤组织进行基因芯片实验, 并应用支持向量机对基因表达谱数据进行分析, 结果发现了一小类可能用于肿瘤预诊的基因.
3.4 决策树(decision trees) 决策树是一种常用于预测模型的算法, 它通过将大量数据有目的的分类, 从中找到一些有价值的, 潜在的信息. 它的主要优点是描述简单, 分类速度快, 特别适合大规模的数据处理[57]. Dettling et al[58]比较了不同决策树算法对基因表达谱分析的影响. Middendorf et al[59]应用决策树方法研究了简单生物的基因调节机制.
3.5 人工神经网络法(artificial neural network, ANN) ANN是一种应用类似于大脑神经突触联接的结构进行信息处理的数学模型. 在这一模型中, 大量的节点(或称＂神经元＂, 或＂单元＂)之间相互联接构成网络, 即＂神经网络＂, 以达到处理信息的目的. 其优势是运行分析时无需在心目中有任何特定模型, 而且, 神经网络可以发现交互作用效果(如年龄和性别的组合效果)[60]. O'Neill et al[61]将神经网络法应用于淋巴瘤基因表达谱数据的分析, 该方法对淋巴瘤预后和诊断都具有较好的判别作用. Sawa et al[62]对酵母属基因表达谱数据进行了欧氏距离、相关系数、相互信息和基于神经网络的聚类分析, 发现基于神经网络的聚类结果较前3种方法更为合理. 
4  其他分析
4.1 主成分分析(principal component analysis, PCA) 在大规模基因表达数据的分析工作中, 由于组织样本例数远远小于所观察基因个数, 如果直接采用前述聚类分析可能产生较大误差, 故需要对聚类算法进行改进. 目前已经提出很多改进的聚类方法, 其中较为流行的方法是应用主成分分析方法对数据进行分析[63,64]. 主成分分析的目的是要对多变量数据矩阵进行最佳综合简化. 使用的方法是寻找这些变量的线性组合－称之为主成分, 使这些主成分间不相关. 为了能用尽量少的主成分个数去反映原始变量间提供的变异信息, 要求各主成分的方差从大到小排列, 第一主成分最能反映数据间的差异. 主成分分析通过合并原来的维数得到更少的维数来表示对象, 同时要求新的维数必须尽可能地反映原有维数所反映的信息, 它有较少的信息丢失. 主成分分析有助于简化分析和多维数据的可视化[65]. 如Crescenzi et al[66]应用主成分分析对60个肿瘤细胞株的基因表达谱数据进行分析, 结果发现肿瘤分型相关的基因有1 375个, 主成分分析得到细胞运动等5个独立的成份. 主成分分析是把原来多个变量化为少数几个综合指标的一种统计分析方法. 从数学角度来看, 这是一种降维处理技术. 而且使这些较少的综合指标既能尽量多地反映原来较多指标所反映的信息, 同时它们之间又是彼此独立的. 但是使用该方法可能导致一部分有用信息的丢失. 为此, Yeung et al[67]采用两个真实数据集和三个模拟数据集作为实验材料, 对采用主成分分析方法所得出的聚类结果作了评估. 他们发现, 进行主成分处理后的聚类质量没有明显提高, 甚至有所降低. 基于以上研究结果, 他们不主张使用PCA方法进行聚类分析.
4.2 基因网络分析(gene network analysis) 基因表达分析包括3个层次[68], 首先是单基因水平, 即比较对照组与实验组的每个基因是否存在表达差异, 这主要指差异基因表达分析; 其次是多基因水平, 如按照基因的共同功能、相互作用、共同表达等进行的聚类分析; 最后是系统水平, 即以基因网络形式解释和理解生命现象. 在生物体系中, 基因从来不是单独起作用的, 它们相互作用呈网络状, 因此从网络的观点分析基因表达谱数据必然会导致对生物系统的更高层次的理解, 目前研究者们已经开始了这方面的研究. 正如前述的各种聚类方法, 假如几个基因被聚类在同一组, 它们有可能是共同表达的基因或者是有同样的信号通径, 深入分析这些基因的增强子可能发现它们共同的调节元件, 从而揭示生物系统更高层次的网络[69]. 另外应用目前已知全序列的模式生物(如酵母、结核分枝杆菌), 人们已研制出加载有他们全基因的芯片, 通过比较不同条件下(突变、基因撬出或设计时间系列)表达谱的变化, 再使用贝叶斯网络法等进行系统分析, 可揭示基因功能和调控网络[70]. 此外还可从代谢等角度研究, 比如从新陈代谢分析基因表达的网络关系等.
    总之, 基因芯片数据分析的方法众多, 随着研究的进展不断地有新的数学方法应用于芯片的数据分析中步研究

5   参考文献
1       Reimers M. Statistical analysis of microarray data. Addict Biol  2005; 10: 23-35
2      Hackl H, Cabo FS, Sturn A, Wolkenhauer O, Trajanoski Z. Analysis of DNA microarray data. Curr Top Med Chem
2004; 4: 1357-1370
3      Leung YF, Cavalieri D. Fundamentals of cDNA microarray data analysis. Trends Genet  2003; 19: 649-659
4     Gerhold D, Lu M, Xu J, Austin C, Caskey CT, Rushmore T. Monitoring expression of genes involved in drug metabolism
and toxicology using DNA microarrays. Physiol Genomics  2001; 5: 161-170
5     Mutch DM, Berger A, Mansourian R, Rytz A, Roberts MA. The limit fold change model: a practical approach for selecting differentially expressed genes from microarray data. BMC Bioinformatics 2002; 3: 17
6     Yang IV, Chen E, Hasseman JP, Liang W, Frank BC, Wang S, Sharov V, Saeed AI, White J, Li J, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Within the fold: assessing differential expression measures and reproducibility in microarray assays. Genome Biol  2002; 3: research0062
7     Black MA, Doerge RW. Calculation of the minimum number of replicate spots required for detection of significant gene expression fold change in microarray experiments. Bioinformatics  2002; 18: 1609-1616
8     Cui X, Churchill GA. Statistical tests for differential expression in cDNA microarray experiments. Genome Biol
2003; 4: 210
9     Raraty MG, Murphy JA, Mcloughlin E, Smith D, Criddle D, Sutton R. Mechanisms of acinar cell injury in acute pancreatitis. Scand J Surg  2005; 94: 89-96
10   Baldi P, Long AD. A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data: regularized t-test and statistical inferences of gene changes. Bioinformatics  2001; 17: 509-519
11   Long AD, Mangalam HJ, Chan BY, Tolleri L, Hatfield GW, Baldi P. Improved statistical inference from DNA microarray data using analysis of variance and a Bayesian statistical framework. Analysis of global gene expression in Escherichia coli K12. J Biol Chem  2001; 276: 19937-19944
12   Pavlidis P. Using ANOVA for gene selection from microarray studies of the nervous system. Methods 2003; 31: 282-289
13   Hatfield GW, Hung SP, Baldi P. Differential analysis of DNA microarray gene expression data. Mol Microbiol
2003; 47: 871-877
14   Pan KH, Lih CJ, Cohen SN. Analysis of DNA microarrays using algorithms that employ rule-based expert knowledge. Proc Natl Acad Sci USA  2002; 99: 2118-2123
15   Aubert J, Bar-Hen A, Daudin J, Robin S. Correction: Determination of the differentially expressed genes in microarray experiments using local FDR. BMC Bioinformatics  2005; 6: 42
16   Pawitan Y, Murthy KR, Michiels S, Ploner A. Bias in the estimation of false discovery rate in microarray studies. Bioinformatics  2005; 21: 3865-3872
17   Pawitan Y, Michiels S, Koscielny S, Gusnanto A, Ploner A. False discovery rate, sensitivity and sample size for microarray studies. Bioinformatics  2005; 21: 3017-3024
18   Grant GR, Liu J, Stoeckert CJ Jr. A practical false discovery rate approach to identifying patterns of differential expression in microarray data. Bioinformatics  2005; 21: 2684-2690
19   Zhao Y, Pan W. Modified nonparametric approaches to detecting differentially expressed genes in replicated microarray experiments. Bioinformatics  2003; 19: 1046-1054
20   Troyanskaya OG, Garber ME, Brown PO, Botstein D, Altman RB. Nonparametric methods for identifying differentially expressed genes in microarray data. Bioinformatics  2002; 18: 1454-1461
21   Efron B, Tibshirani R. Empirical bayes methods and false discovery rates for microarrays. Genet Epidemiol
2002; 23: 70-86
22   Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.
Proc Natl Acad Sci USA  2001; 98: 5116-5121
23   Pan W, Lin J, Le CT. A mixture model approach to detecting differentially expressed genes with microarray data. Funct Integr Genomics  2003; 3: 117-124
24   Strimmer K. Modeling gene expression measurement error: a quasi-likelihood approach. BMC Bioinformatics
2003; 4: 10
25   Segal MR, Dahlquist KD, Conklin BR. Regression approaches for microarray data analysis. J Comput Biol
2003; 10: 961-980
26   Li H, Gui J. Partial Cox regression analysis for high-dimensional microarray gene expression data. Bioinformatics
2004; 20: I208-I215
27   Huang X, Pan W. Linear regression and two-class classification with gene expression data. Bioinformatics  2003; 19: 2072-2078
28   Azuaje F. Clustering-based approaches to discovering and visualising microarray data patterns. Brief Bioinform
2003; 4: 31-42
29   Guess MJ, Wilson SB. Introduction to hierarchical clustering. J Clin Neurophysiol  2002; 19: 144-151
30   Levenstien MA, Yang Y, Ott J. Statistical significance for hierarchical clustering in genetic association and microarray expression studies. BMC Bioinformatics  2003; 4: 62
31   Bertucci F, Salas S, Eysteries S, Nasser V, Finetti P, Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Loriod B, Bachelart L, Montfort J, Victorero G, Viret F, Ollendorff V, Fert V, Giovaninni M, Delpero JR, Nguyen C, Viens P, Monges G, Birnbaum D, Houlgatte R. Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. Oncogene  2004; 23: 1377-1391
32    Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H, Hastie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, Thorsen T, Quist H, Matese JC, Brown PO, Botstein D, Eystein Lonning P, Borresen-Dale AL. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 10869-10874
33    Sherlock G. Analysis of large-scale gene expression data. Brief Bioinform  2001; 2: 350-362
34    D'ambrosio C, Akin C, Wu Y, Magnusson MK, Metcalfe DD. Gene expression analysis in mastocytosis reveals a highly consistent profile with candidate molecular markers. J Allergy Clin Immunol  2003; 112: 1162-1170
35    Steinley D. Local optima in K-means clustering: what you don't know may hurt you. Psychol Methods  2003; 8: 294-304
36    Toronen P, Kolehmainen M, Wong G, Castren E. Analysis of gene expression data using self-organizing maps. FEBS Lett  1999; 451: 142-146
37    Covell DG, Wallqvist A, Rabow AA, Thanki N. Molecular classification of cancer: unsupervised self-organizing map analysis of gene expression microarray data. Mol Cancer Ther  2003; 2: 317-332
38    Getz G, Levine E, Domany E. Coupled two-way clustering analysis of gene microarray data. Proc Natl Acad Sci USA
2000; 97: 12079-12084
39    Hastie T, Tibshirani R, Eisen MB, Alizadeh A, Levy R, Staudt L, Chan WC, Botstein D, Brown P. 'Gene shaving' as a method for identifying distinct sets of genes with similar expression patterns. Genome Biol  2000; 1: RESEARCH0003
40   Jiang H, Deng Y, Chen HS, Tao L, Sha Q, Chen J, Tsai CJ, Zhang S. Joint analysis of two microarray gene-expression data sets to select lung adenocarcinoma marker genes. BMC Bioinformatics 2004; 5: 81 rats. Dig Dis Sci  1995; 40: 2162-2169
41   Lazzeroni L, Owen A. Plaid models for gene expression data. Statistica Sinica  2002; 12: 61-86
42    Plaid models, for microarrays and DNA expression Available from: URL: http://www-stat. stanford. edu/~owen/plaid
43   Wang J, Delabie J, Aasheim H, Smeland E, Myklebost O. Clustering of the SOM easily reveals distinct gene expression patterns: results of a reanalysis of lymphoma study. BMC Bioinformatics 2002; 3: 36
44   Herrero J, Dopazo J. Combining hierarchical clustering and self-organizing maps for exploratory analysis of gene expression patterns. J Proteome Res  2002; 1: 467-470
45    Tsai CA, Lee TC, Ho IC, Yang UC, Chen CH, Chen JJ. Multi-class clustering and prediction in the analysis of microarray data. Math Biosci  2005; 193: 79-100
46   Brock A, Huang S, Ingber DE. Identification of a distinct class of cytoskeleton-associated mRNAs using microarray technology. BMC Cell Biol  2003; 4: 6
47   Billings SA, Lee KL. Nonlinear fisher discriminant analysis using a minimum squared error cost function and the
orthogonal least squares algorithm. Neural Netw  2002; 15: 263-270
48    Cho JH, Lee D, Park JH, Lee IB. Gene selection and classification from microarray data using kernel machine. FEBS Lett  2004; 571: 93-98
49   Dangond F, Hwang D, Camelo S, Pasinelli P, Frosch MP, Stephanopoulos G,Stephanopoulos G, Brown RH Jr, Gullans SR. Molecular signature of late-stage human ALS revealed by expression profiling of postmortem spinal cord gray matter. Physiol Genomics  2004;16: 229-239
50   Friedman N, Linial M, Nachman I, Pe'er D. Using Bayesian networks to analyze expression data. J Comput Biol  2000; 7: 601-620
51    Imoto S, Higuchi T, Goto T, Tashiro K, Kuhara S, Miyano S. Combining microarrays and biological knowledge for estimating gene networks via bayesian networks. J Bioinform Comput Biol  2004; 2: 77-98
52   Kim SY, Imoto S, Miyano S. Inferring gene networks from time series microarray data using dynamic Bayesian networks. Brief Bioinform  2003; 4: 228-235
53   Furey TS, Cristianini N, Duffy N, Bednarski DW, Schummer M, Haussler D. Support vector machine classification and validation of cancer tissue samples using microarray expression data. Bioinformatics  2000; 16: 906-914
54   Buerstatte CR, Behar KL, Novotny EJ, Lai JC. Brain regional development of the activity of alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex in the rat. Brain Res Dev Brain Res  2000; 125: 139-145
55   Liu Y. Active learning with support vector machine applied to gene expression data for cancer classification. J Chem Inf Comput Sci 2004; 44: 1936-1941
56   Williams RD, Hing SN, Greer BT, Whiteford CC, Wei JS, Natrajan R, Kelsey A, Rogers S, Campbell C,Pritchard-Jones K, Khan J. Prognostic classification of relapsing favorable histology Wilms tumor using cDNA microarray expression profiling and support vector machines. Genes Chromosomes Cancer  2004; 41: 65-79
57   Podgorelec V, Kokol P, Stiglic B, Rozman I. Decision trees: an overview and their use in medicine. J Med Syst  2002; 26: 445-463
58   Dettling M, Buhlmann P. Boosting for tumor classification with gene expression data. Bioinformatics 2003; 19: 1061-1069
59   Middendorf M, Kundaje A, Wiggins C, Freund Y, Leslie C. Predicting genetic regulatory response using classification. Bioinformatics 2004; 20 Suppl 1: I232-I240
60   Agatonovic-Kustrin S, Beresford R. Basic concepts of artificial neural network (ANN) modeling and its application in pharmaceutical research. J Pharm Biomed Anal  2000; 22: 717-727
61   O'Neill MC, Song L. Neural network analysis of lymphoma microarray data: prognosis and diagnosis near-perfect. BMC Bioinformatics  2003; 4: 13
62    Sawa T, Ohno-Machado L. A neural network-based similarity index for clustering DNA microarray data. Comput Biol Med  2003; 33: 1-15
63   Wang A, Gehan EA. Gene selection for microarray data analysis using principal component analysis. Stat Med  2005; 24: 2069-2087
64   Sharov AA, Dudekula DB, Ko MS. A web-based tool for principal component and significance analysis of microarray data. Bioinformatics 2005; 21: 2548-2549
65   Liu A, Zhang Y, Gehan E, Clarke R. Block principal component analysis with application to gene microarray data classification. Stat Med  2002; 21: 3465-3474
66   Crescenzi M, Giuliani A. The main biological determinants of tumor line taxonomy elucidated by a principal component analysis of microarray data. FEBS Lett  2001; 507: 114-118
67    Yeung KY, Ruzzo WL. Principal component analysis for clustering gene expression data. Bioinformatics  
2001; 17: 763-774
68    Slonim DK. From patterns to pathways: gene expression data analysis comes of age. Nat Genet 2002; 32 Suppl: 502-508
69   Hudson ME, Quail PH. Identification of promoter motifs involved in the network of phytochrome A-regulated gene expression by combined analysis of genomic sequence and microarray data. Plant Physiol  2003; 133: 1605-1616
70   Gutierrez-Rios RM, Rosenblueth DA, Loza JA, Huerta AM, Glasner JD, Blattner FR, Collado-Vides J. Regulatory network of Escherichia coli: consistency between literature knowledge and microarray profiles. Genome Res  2003; 13: 2435-2443

Jaylen

Applause for your shareing

北邙阳阳

好复杂啊，我该选什么啊

Jaylen

What about SBS and DNB sequencing procedure？